こんにちは。
現在、骨芽細胞の培地に試料を添加して、Bmp-2のmRNA転写が増大するかどうかを２ステップの定量リアルタイムPCRで確認することを試みていますが相対定量法でBmp-2の検量線を引くことができず困っております。
使用機器はApplied BiosystemsのStep one plus、試薬はFast SYBR Green mastert mixを使用しています。
試料のcDNAはtotal RNAは4 μgを逆転写したもので希釈系列を作って標準cDNA溶液としてリアルタイムPCRに供しています。
上記条件でリアルタイムPCRを行いましたが逆転写産物溶液そのままの濃度でCt値が30前後となっており、また、同濃度でのCt値のばらつき(n =3 でやっています）が大きく、一応はcDNA濃度に対応したCtが出る傾向にはありますが、検量線を引いたときに相関係数の値が検量線として実用するのにたえないものとなっております。
手技の問題については、よく内部標準コントロールとしても用いられるβアクチンやGAPDHでは検量線がきちんと引けているの問題ないと思っております。
そこで下記の質問を致します。
・逆転写反応キットで一度に逆転写できる濃度のtotal RNAを逆転写し、その反応液をcDNA試料として２ステップリアルタイムPCRにかけていますが、プライマーの問題はさておき、上述したようにCt値が30前後なのでBmp-2はmRNA転写量が少ない遺伝子なのか？と思っております。
そのような転写量の少ない遺伝子のmRNAを検出するのに2ステップリアルタイムPCRは向いているのか？
ということです。
また、Bmp-2についてリアルタイムPCRでmRNA転写量を見たことがある方がいましたら、total RNAあるいはcDNAの濃度、機器、試薬の仕様（機種名や試薬名、１ステップか2ステップかなど）を簡単にでも教えていただけましたら幸いです。 |
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