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(無題) 削除/引用 No.7422-4 - 2018/11/21 (水) 14:36:10 - rdftgy LC-MS/MS解析するならば、IgGが混じっててもかならずしも解析の障害にはならないです。normal IgGまたはnon-related IgGをコンジュゲートしたnegative control beadsのほうにもそれは出るでしょうから、これはBGと識別できるので、差し引きできます。検体とは種もちがうでしょうから、MSデータの解析時に動物種を指定することでも排除できるとおもいます。 お金があれば、SILACとかポストラベルとか手法を取り入れればnon-specificなバックグラウンドが沢山あるなかでも本物を識別できます。

(無題) 削除/引用 No.7422-3 - 2018/11/21 (水) 14:05:05 - rdftgy 抗体とビーズの間の架橋は現実には100%ではないので架橋しそこなった抗体がどうしても少なからずいます（この辺は製品の質や性能にかなり左右される。）。これらも(特にセファロースやアガロース系の)ビーズにはゆるくくっついてそれなりに残存するので、SDS bufferで洗えばビーズから取れて溶出物に混入します。もちろん量的には少ないので蛋白質染色では検出されないかもしれないですが、WBするとしばしば強いしぐなるとして検出されます。IPするまえに抗体ビーズを0.1M Glycine-HCL buffer (~pH2.5)で１回さくっとあらってから使うと、架橋できてなかった抗体はこのときにかなり除けます。and/or 溶出bufferを 少量の0.1~0.2M Glycine -HCl buffer (pH2.5）にするとSDSで溶出するよりはバックグラウンドの持ち込みを減らす事が出来て純度あがります。 もちろん溶出物はすぐに1MTris(pH9.0)等を適量入れて中和します。

(無題) 削除/引用 No.7422-2 - 2018/11/21 (水) 13:48:01 - あかね 抗体はH鎖とL鎖によって構成され、両者はSS結合によって接着しています。 例えば、H鎖がビーズにクロスリンクされれば、L鎖はSS結合によって繋ぎ止められている状態ですので、 IPした後のSDS bufferに還元剤を入れなければ、問題ないでしょう。

抗体カラムの自家調製 削除/引用 No.7422-1 - 2018/11/21 (水) 12:29:18 - 抗体カラム こんにちは。 免疫沈降による複合体解析を行いたいです。 タグ付きの抗体でプルダウン（プロテインGビーズを使用）し、SDSサンプルバッファーで溶出、CBB解析すると、やはり抗体はもちろん溶出されてきます。これをどうにか抑えたいです。 そこで抗体をビーズにカップリングできればと思い、いくつかキットを調べています。 AminoLink™ Plus Coupling Resin（サーモ社） Catalog number: 20501 AminoLink™ Coupling Resin（サーモ社） Catalog number: 20381 Pierce™ NHS-Activated Agarose Slurry（サーモ社） Catalog number: 26200 などです。 ここに良い表がありました。 thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-purification-isolation/protein-purification/protein-immobilization.html 抗体ですので、Pierce™ NHS-Activated Agarose Slurry（サーモ社）がいい感じです。 質問なのですが、一旦、抗体をこのアガロースにコンジュゲーションさえしてしまえば、実際にプルダウンに用いて、その後、SDSサンプルバッファーで溶出する際、抗体は溶出されてこないのでしょうか？ あるいは、多少なり溶出してしまうものでしょうか？ こういった経験がありませんので、感覚をお聞かせいただけますと幸いです。 宜しくお願いします。

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