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(無題) 削除/引用 No.7414-3 - 2018/11/17 (土) 15:06:52 - 中年 > その方法としてこれまで受容体XとヒトIgGの組換え融合タンパク質を作製し、リガンドYノックアウトマウスのembryo lysateからプルダウンして質量分析計によって同定を試みていましたが、コントロールFcと大差なく、Xをbeitに用いた時では何も検出されませんでした。 その方法で野生型マウス由来のembryo lysateからYが検出できますか。 発現クローニングを試すなら、まずはY発現細胞がその方法で十分濃縮されることを確認してみては？

(無題) 削除/引用 No.7414-2 - 2018/11/17 (土) 14:58:57 - おお >羊土社のDNAライブラリーの指南書も2000年出版で古く、 このころには方法論的にも成熟していたといってもいいでしょう。実際１９９０年代にはCosなどにライブラリーを発現させてサイトカインリセプターなどいろいろなものがクローニングされている。とくにサイトカイン関係は日本人がかなり寄与している。 自前で出来るといえば出来るけど、チェックポイントはいろいろあり、プロトコール集にあまりかかれてなかったりもするので、複数のものを参考にして慎重にやらないと、あまりよくない結果になる可能性もおおい。 しかし、COSに発現してメリットあるの？どうもFunctioning cloningのStrategyが見えてこないけど。

受容体Xのリガンド同定方法 削除/引用 No.7414-1 - 2018/11/17 (土) 14:23:31 - 理科I類M2 こんにちは。初めて投稿させてもらいます。よろしくお願いします。 私はある受容体Xのリガンドを同定できればと考えています。 受容体Xにはこれまでのところたった一つのリガンドYが報告されていますが、受容体Xはレクチンになりますので、おそらく広範なリガンド認識を取っていると考えています。 その方法としてこれまで受容体XとヒトIgGの組換え融合タンパク質を作製し、リガンドYノックアウトマウスのembryo lysateからプルダウンして質量分析計によって同定を試みていましたが、コントロールFcと大差なく、Xをbeitに用いた時では何も検出されませんでした。 次に発現クローニングではどうかと、まず COS細胞でリガンドYのノックアウトをCRISPR-Cas9で作製しました。この細胞をcDNAライブラリーを導入する容器として使用し、発現クローニング法で同定できないか考えています。 ここまで自力で出来ましたが、cDNAライブラリーの作製は周りに聞ける人がおらず、羊土社のDNAライブラリーの指南書も2000年出版で古く、この購入にためらいがあります。 考えていることは、リガンドYノックアウトマウスの組織からcDNAライブラリーを作製し、ウイルスを用いてYのノックアウトCOSにライブラリーを感染発現させ、受容体XとヒトIgGの組換え融合タンパク質で染まる細胞をソートし、DNA解析により導入された遺伝子を同定するという方法を用いたいです。 これを行うにはリガンドYノックアウトマウスからcDNAライブラリーを作製しないといけません。 これは受託で作製してもらった方がいいでしょうか？それとも自前で行えるものでしょうか？ 2018年代のこの辺りの常識というのがわかっていませんので、どれがよいのかもしこの辺りい明るい方がいらっしゃれば情報をシェアしていただけませんでしょうか？ よろしくお願いします。

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