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リゾチームとＳＤＳを使って大腸菌のDNAを抽出する方法について トピック削除
No.7413-TOPIC - 2018/11/17 (土) 08:22:46 - 物理専攻
リゾチーム濃度1.5mg/ml SDS　1％　でやっているのですが、最初にやったときはSDSを加えた直後後白濁し一時間後にはネバネバしたポリマーの大きめ固まりのような物が採取出来ました。それ以降何度やってもSDSを加えた直後は細かい白くふわふわしたものがでてくるのですが、5分くらいで溶液が完全に透明になり最初のときのような固まりが一切無くなってしまいました。ある理由でその固体が必要なのですが、どうすればいいでしょうか？
　
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No.7413-7 - 2018/11/18 (日) 20:33:51 - mon
大腸菌のゲノムDNAを抽出することはさほどメジャーでないし、いくつか方法(バリエーションかな）はあります。そのため、もう少しプロトコールの詳細（buffer組成や操作）を記載しないと、抽象的な答えになり問題の解決につながりそうにないです。
ちなみに中性的緩衝液にEDTAが入っていればDNAは簡単に分解されませんが、ピペッティングなどの物理的操作によって剪断されてネバネバ（長いDNA)はサラサラ（短い断片：20kb以下）になります。

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No.7413-6 - 2018/11/17 (土) 11:43:33 - おお
やり方によって得られる物の構成や性質なども変わってくるだろうし、それがあなたにとって良い方法なのかもわかりませんので、そうしなさいといえません。最初のやり方でできるようにどの点が結果に影響するか見極めながらやっていくほうがいいんじゃないですか？

アルカリLysis法というのがあって、SDSをふくむアルカリ溶液で大腸菌を壊しDNAなども一度可溶化して、酢酸を含む溶液を加えてSDSとそれに絡みつくDNA（おもに大腸菌のゲノム）を沈殿させる方法は、プラスミドのような比較的小さいDNAを沈殿させないので、プラスミド抽出によく使われます。

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No.7413-5 - 2018/11/17 (土) 10:47:12 - 物理専攻
ありがとうございます。確認させていただきたのですが、自分がねばねばした固体を採取するためには　@SDS溶液のpHを下げてSDSの溶解度を下げる　という方法をもちるということでいいでしょうか？

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No.7413-4 - 2018/11/17 (土) 10:32:24 - おお
SDSが蛋白やDNAを巻き込んで沈殿してしまうということです。あなたの詳しいプロトコールはよくわかりませんが、そういう手法はよく使われます。培地の持ち込みなどからpHが下がっていればSDSの溶解度はさがり可溶化作用がよわまり、うまく行ったのかもしれません。

DNAが分解しているとしたならば、もしかしたら大腸菌が増えすぎて死菌が多くを締めている可能性があります。またMgイオンが含まれているとDNA蛋白の構造が安定化して沈殿しやすくなる可能性がありますが、あなたの目的に合うかどうかよくわかりません。

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No.7413-3 - 2018/11/17 (土) 09:47:27 - 物理専攻
私が必要なのはねばねばしたもので、それはSDSではなくDNAと大腸菌の断片の集まりで、以降の実験ではDNAが分解されてしまったため透明になってしまったと考えているいます。

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No.7413-2 - 2018/11/17 (土) 09:14:15 - おお
SDSの析出は塩濃度やpHにセンシティブだと思いますが、、、一度溶出したものが析出するのと溶けないで析出するのでも違うかもしれません。

リゾチームとＳＤＳを使って大腸菌のDNAを抽出する方法について 削除/引用
No.7413-1 - 2018/11/17 (土) 08:22:46 - 物理専攻
リゾチーム濃度1.5mg/ml SDS　1％　でやっているのですが、最初にやったときはSDSを加えた直後後白濁し一時間後にはネバネバしたポリマーの大きめ固まりのような物が採取出来ました。それ以降何度やってもSDSを加えた直後は細かい白くふわふわしたものがでてくるのですが、5分くらいで溶液が完全に透明になり最初のときのような固まりが一切無くなってしまいました。ある理由でその固体が必要なのですが、どうすればいいでしょうか？
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