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(無題) 削除/引用 No.7407-9 - 2018/11/16 (金) 00:35:56 - y 欠失がCCCTG"CGGC"Aではなくて、 CCCT"GCGG"CAってことでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7407-8 - 2018/11/15 (木) 18:34:53 - asan CRISPRの受精卵injectionのプロトコールはF0で結構な割合でモザイクがでますからおそらくtailかどこかわかりませんがジェノタイプしたDNAが100%出なかった可能性が高いでしょう。受精卵injectionの方法の性質上工夫してちかづけることはできますが、これは100%キメラができる保証がないのはわかると思います。 また、このような理由からF0で良好な結果がでたとしてもとりあえずF1世代で確認するまで生殖に乗ってるかどうかわからないので、それ以外の個体を捨てない方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.7407-7 - 2018/11/15 (木) 18:06:43 - AA 会社から受け取ったマウスはF0世代でしょうか？(Cas9を受精卵に持ち込んだ世代) F1世代であれば必ずヘテロなので違う話になりますが、 F0世代であれば、問題の塩基のところにGを持つものとCを持つものの マルチアリルモザイクであった、という可能性も考えられます。 この場合は問題の塩基の部分のシークエンス結果は、Gが優勢になるので 見かけ上G----Aというふうに見えても仕方ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.7407-6 - 2018/11/15 (木) 16:47:29 - AP それは抗体遺伝子の多様性を作るメカニズムに限ったことですね。 gene conversionはHoliday modelを導いた現象で、strand exchangeがおこる生物なら原理的に起こりえます。キアズマができるたびに確率的に生じうるのでかなりの頻度で起こっているはずですが、自分の着目している配列にあたるということは珍しいかもしれません。今回のケースがそうかどうかは断言できませんけど。

(無題) 削除/引用 No.7407-5 - 2018/11/15 (木) 16:36:29 - 海 AP先生 ありがとうございます。知りませんでした。 確か免疫学の授業で、抗体の多様性は体細胞突然変異、クラススイッチ組換え、遺伝子転換によりなされるが、遺伝子転換は鳥やうなぎだったか?のみ、と習いましたので、そうだと思っていました。 今回のことはよく起こりうるものなのでしょうか？ 初めての経験で大変驚いています。 わたしも培養細胞でノックアウトを作ったことありますが、配列が突然変わるなんてことは起きたことがないです。。

(無題) 削除/引用 No.7407-4 - 2018/11/15 (木) 16:28:05 - AP >gene conversion...これは鳥などでのみ見られる現象で、人やマウスでは起こらないものだと思っていました。 なんで鳥だけだと？ 真菌からショウジョウバエから哺乳類だって、

(無題) 削除/引用 No.7407-3 - 2018/11/15 (木) 14:51:21 - 海 AP先生、ありがとうございます。 はい、問題は受託先の配列データと、自前の配列データが異なっているということです。 もう一度PCRをやり直して配列決定までの流れを繰り返して再現性を見る予定ではありますが、2匹ずつのマウス（WT2匹、 KO2匹)の配列の結果は一致しているので、PCRエラーとは考えてはいません。 が、まずはもう一度やってみます。 gene conversion...これは鳥などでのみ見られる現象で、人やマウスでは起こらないものだと思っていました。 では、まず今回の親や、その親のジェノタイプも配列決定すると何かわかるかもしれませんね。 今、受託先にもこの現象を知らせています。 なんだか気持ちが悪いですね・・・ > シークエンスのエラーでなければ、 > たとえば、gene conversionが起こった。子孫をたまたま選択して継代した。 > つまり当該箇所近傍で交差がおこったとき、WTとKOでヘテロ二重鎖ができて、ミスマッチ修復の過程でそういう染色体産物ができた。 > たとえば、 > WT: CCCTGCGGcA--------- > KO: CCCT----gA---------(実際は相補鎖） > という中間帯でg->cのconversionが起こった。 > >

(無題) 削除/引用 No.7407-2 - 2018/11/15 (木) 13:42:00 - AP 量鎖切断（DSB)に続くNHEJで欠失だけでなく塩基挿入が起こること自体は珍しくありませんが、問題は委託先のシークエンスデータと自前のそれとがくいちがっているということですね。 シークエンスのエラーでなければ、 たとえば、gene conversionが起こった。子孫をたまたま選択して継代した。 つまり当該箇所近傍で交差がおこったとき、WTとKOでヘテロ二重鎖ができて、ミスマッチ修復の過程でそういう染色体産物ができた。 たとえば、 WT: CCCTGCGGcA--------- KO: CCCT----gA---------(実際は相補鎖） という中間帯でg->cのconversionが起こった。

CRISPRでのKOマウス作製でおかしな現象 削除/引用 No.7407-1 - 2018/11/15 (木) 07:26:35 - 海 一つ質問させてください。 興味ある遺伝子Xのノックアウトマウスを作製するため、CRISPR-Cas9によるマウス作製受託を行いました。 会社からヘテロのマウスが作製できたと連絡を受け、そのデータを受け取りました。 特異的なジェノタイププライマーも作製でき、一応念のため最初だけそのPCRプロダクトの配列を読みました。 すると、予想どおり4つの塩基CGGCの欠損が認められました。 ところが会社から送られて来たヘテロの両アリルの配列データには以下のようだったのですが、 CCCTG"CGGC"A CCCTG A ところが、私が今日、WTとノックアウトマウスとジェノタイプPCRの結果から思われるPCR産物をシークエンス解析したところ、 WTマウスの両アリルは CCCTG"CGGC"A CCCTG"CGGC"A ノックアウトマウスの両アリルは CCCTc　　　　A CCCTc　　　　A となっていました。 確かに4塩基脱落しているんですが、それ以外にもGからCへの塩基の置換が認められました。 これはなぜでしょうか？ もちろんPCRエラーの可能性もあるかと思います（PCR産物はせいぜい300bpほどなので可能性としては低いと思いますが） それ以外に、これをどう解釈してよいものか、わかりません。 シークエンスは綺麗に250塩基ほど読めており、この編集部はシークエンスのちょうど中央部に位置しており、綺麗に読めています。 会社から送られて来たデータにも実際の配列データ（波形）が添付されており、間違いないようです。 なぜヘテロのマウスには認められない変異が、ホモのマウスで認めらたのか説明がつきません。 正直4つの塩基が欠落していればノックアウトの完成なので、気にすることもないのかもしれませんが、気になります。そのような経験ありますでしょうか？

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