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(無題) 削除/引用 No.7404-16 - 2018/11/15 (木) 04:54:20 - おお >なんとか試薬Aを買ってもらえるという状況です。 それで改善しましたか？ WBに関してはその抗体を他の人が使ってなかったですか？ バックグランドについてはきりがないほどやれることがあります（必ずしも良い方法が見つかるわけではないですが）。 まあ最初は抗体濃度を下げることですね。 ブロッキング剤の幅は広いです。カゼイン、BSA、PVP、ゼラチン、PEG、血清など。ここで検索すれば濃度などのヒントもみつかるとおもいます。抗体を希釈するバッファーも塩濃度を上げたり、pHをふったり、デタージェント濃度を上げたり、場合によっては変えることも。同じ抗体をつかっている論文があればその条件が参考になるかもしれません。 非特異の吸収も（特にポリクロなら）有効な場合もあります。同じような細胞からLysatesを用意して、コームをささずにスタッキングをつくり（分離ゲルとどうよう水などを上から注ぐといいでしょう）、サンプルをスタッキングゲルのうえにのせ電気泳動し、Transferすると一面に蛋白がのったMembraneができます。WB用に作った抗体を希釈した液を、WBの膜に晒す前に上記で作ったMembraneとIncubationしてノンスペがでる抗体分子をTrapします。その後にWBにつかうとより非特異なバンドがへることがあります。もちろん吸収用のMembraneもターゲットの蛋白があるので、スペシフィックな抗体もそこにつくでしょう。しかしそれは量として影響があるほどではないでしょう。じっさい多くのWB用に希釈した抗体溶液が複数回のWBに使えますから。どうしてもいやならターゲットのバンドがある辺りの部分は切り取ってしまえばいいかもしれません。 またWB用に希釈した抗体溶液にLysateを混ぜて直接ノンスペを中和するという大胆な方法もありえるやりかたです。 たしかに抗体は当たり外れがあるから、あまり良くないと思ったら違うものを買えばいいというのは一つのやり方ですが、決まったペプチドからの抗体が必要でそれ以外の配列では困るときなど、どの抗体でもOKとはならないので、上記のような工夫をするしかありません。 また特異的なバンドを見分けるには発現量が調べられているいろいろな細胞臓器などから手に入るものを使って比較しながら判断することもできることの一つです。shRNA発現ベクターを使っているグループの論文があれば、独自の設計ならベクターをもらえるかもしれません。クリスパーの系も実際動かしてみないとわからないわけだし、もしKOした細胞を樹立して報告している論文があればそこから細胞、細胞がだめならそのLysateを分けてもらえるならすぐにできるでしょう。 ちなみに私は野放しにされてたほうがやりやすいとおもうくちです。

(無題) 削除/引用 No.7404-15 - 2018/11/15 (木) 02:30:06 - nanasi この件についての真相はどうあれ、 　 一般的に、生物・医学系の大学教授に　「こんなの」　が多いのも事実だよね。 知能・知識・能力的にも人並み。 「こんな」　教授たちが教授会で新しい教授を決めるから 「こんな」　教授が拡大再生産されていく

(無題) 削除/引用 No.7404-14 - 2018/11/14 (水) 23:51:20 - AA ちなみに大腸菌に発現させるだけなら、 lacプロモーターと目的の蛋白のCDSをつなぐ、というように それほどレアな配列がなくてもできると思います。 おそらく手持ちのものでもパーツは足りるのではないでしょうか？ (アフィニティ精製などはできませんがどれがポジのバンドかくらいは判定できるのでは) 培養細胞で発現させる場合は別のプロモーターが必要ですが、 そのあたりも細胞を飼っているラボなら全く無いことはないのではと思います。 ウェスタンのバンドが汚いときに、洗いの他には変性条件を変えると改善することもありますね。 指導をしてもらえない、と嘆くだけではなく その分自分で考えるようにすれば、先生に言われた実験をこなすだけの人より 成長するチャンスが多い、とも言えると思います。

(無題) 削除/引用 No.7404-13 - 2018/11/14 (水) 23:39:22 - な >内部基準として用いているアクチンに関しては綺麗に非特異的な結合なくバンドが出ています。また目的タンパク質を過発現させるためのベクター購入はすでに提案しており、予算の関係から却下されています。 いや、だからそのplasmidくらい自分で作りなよ、ってことです。 >確実性は低いですがベクター購入よりも安い、目的タンパク質の阻害剤が5000円で売られていたため、その提案をしたという流れです。 全く論理的じゃないです。 1円でも無駄に出来ない状況なのに、確実性がかなり低い" 阻害剤でタンパク質が低下する" ことを提案されて、おそらく教授は貴方を見切ったのかもしれません。 私なら" なんでそんなものも分からないんだ。" と思い、一切の聞き耳を捨てます。 >ちなみにクリスパーに関してはシステムをもってもらず、以前システム導入を持ちかけ承諾してくれはしたものの まずは考える力を論文なりから育ててください。 ちきんと論理的になれるように。じゃないと足元を見られます。

(無題) 削除/引用 No.7404-12 - 2018/11/14 (水) 22:47:36 - dfぐぅ 実情を見ていないので当該ラボのことはコメントできないので、あくまで最近自分が感じる一般的なことですが、10年くらい前までは、｀｀教授自身はもともと出来る人だったり、かなりハードな仕事を経験してるけど、部下や学生を育てるのが下手、というか指導する意思が無い（＝無理な要求する、話を聞かない、トップダウン、相手してくれないとか）｀｀で、学生が離れて行くケースが多かったように思うのですが、最近はそもそも研究遂行能力や資金を得てラボ経営するだけの力量が???の人が少なからず指導的ポジションについているように感じています。 いまは学生が教員を選ぶ時代です。自分のやりたいこと（かそれに近いこと）ができるところがまず一番重要ですが、同時にHPやpubmedで論文業績／研究のアクティビティはわかるし、修了時学位取得者数も大学で調べればわかるでしょうし、研究費獲得状況もHPや科研費のサイトとかで検索できますから、そうした基礎データを総合的によく検討して、加えてラボの雰囲気とか習慣が自分のペースにあうラボを選ぶようにしましょう。 昔ある先生は、とりあえずPIの責務は学生やポスドクがお金（＝研究費残額）の心配せずに研究に没頭できる状況をつくることと言っておりました。

(無題) 削除/引用 No.7404-11 - 2018/11/14 (水) 22:05:07 - moz ノンスペが出るものばかりということは、市販の抗体ではなくラボで作製（依頼）した抗ペプチド抗体（抗血清）でしょうか？ 抗血清のままだと、（免疫した）動物が元から持っている抗体が非特異的バンドの原因になりますので、残っているハズの抗原ペプチドを使ってペプチドカラムを作りアフィニティー精製すると良いです。 もっともアフィニティーカラムがやや高価ですが。 Washingに関しては、tween20ではなくTritonX100を使うと非特異的バンドが改善することがあります（ただし期待しすぎはNG)。 抗体濃度が濃すぎても非特異的バンドが出やすくなります。今お使いの1/5~1/10,1/50濃度を試してみましょう。 ブロッキング剤を変えてみるのも良く行う方法です。もっとも通常はスキムミルク（あるいはカゼイン）で良好な結果が得られます。 また、抗体反応時の塩濃度を1/5,1/2,x2(+/- 0.1% TritonX100)に振ってみると改善することがあります。

(無題) 削除/引用 No.7404-10 - 2018/11/14 (水) 21:40:49 - おお >目的タンパク質を過発現させるためのベクター購入 同じたんぱく質を発現ベクターで発現している論文があればそういうラボからもらう事もできます。 またタンパクの抽出の仕方で結構のんすぺが回避できたりもします。 ウェスタンのバンドの特定のためポジコンとして目的タンパク質の阻害剤の購入を求められるような状況でもし私が本当に忙しかったら、そういう人の話であれこれ言われるままにものを買うのは躊躇してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.7404-9 - 2018/11/14 (水) 21:34:19 - uno アクチンとかチューブリンとかの内部標準の昔からある抗体は、特異性、親和性の高いいいものばかりなので、うまくいってあたりまえ、なのできれいな結果が出ても、手技がドヘタではない、というくらいにしかいえないと思います。 問題の抗体の非特異性ですが、ブロッキング剤をいろいろ試してみるとか（スキムミルクとか、ゼラチンとかがブロッキング効果は高いと思います）。Tween濃度を0.2%程度にあげてみるとか。メンブレンを変えてみるとか。 あと、ここのフォーラムで過去に見かけたのが、一回blottingに使用した抗体液を回収して再度用いると、非特異に反応する成分がある程度除かれるので、二回目に使用した際の結果がきれいになる、というものでした。 見たいターゲットに対する抗体も減るはずなので、効果はあるのかな？と疑問もありますが、うまくいく場合もあるのかも。 けど、western blotの非特異は抗体を変えるのが一番の近道なんだよなぁ。 SantaCruz社なんかは無料のサンプル品をわりと多く提供しているので、探してみてもいいんじゃないでしょうか(到着まで1-2週間かかりますが)。

(無題) 削除/引用 No.7404-8 - 2018/11/14 (水) 21:09:31 - あんさ みなさんご回答ありがとうございます。 やっぱりよくある状況ではあるんですね。 手技によるエラーは確かにみなさんのご指摘の通り無視はできません。 今回のウェスタンの件に関しては、 内部基準として用いているアクチンに関しては綺麗に非特異的な結合なくバンドが出ています。また目的タンパク質を過発現させるためのベクター購入はすでに提案しており、予算の関係から却下されています。確実性は低いですがベクター購入よりも安い、目的タンパク質の阻害剤が5000円で売られていたため、その提案をしたという流れです。ちなみにクリスパーに関してはシステムをもってもらず、以前システム導入を持ちかけ承諾してくれはしたものの、予算の関係から年度末に予算が余ればということになっています。 長くなってしまい申し訳ありません。 ウェスタンの件に関して何か打つべき手があればご助言お願いします。

(無題) 削除/引用 No.7404-6 - 2018/11/14 (水) 19:44:02 - な 抗体の特異性をいうのき阻害剤というのは非論理的。 か、リン酸化抗体とかならまあわかるかな。 研究を始めてすぐは手技が疎かで、ウエスタンでもたくさんバンドが出てしまうのはあるある。 教授のいうことも分からなくもないです。 ラボのほとんどの抗体がたくさんバンドが出ている以上、では貴方の手技がパーフェクトであるという根拠は何処から来るのですか？ 例えばハウスキーピングなアクチンなどでもたくさんバンドが出てしまうんですか？ 始めたばかりの人がうまくいかない時、それを試薬のせいだと言う人はかなり多いです。特に体育会系な人(つまり頭を使っていない筋肉脳なひと)や中国人に多いです。 アクチンなんかは貴方の手技がパーフェクトかどうかを言ういいコントロールだと思います。 もし、それでも抗体が悪いと言うのであれば、 更に粘ってクリスパーキャスでknockoutを作ったり、plasmidトランスフェクションでポジコンネガコンを作るのもあり。 まずはそれだけ私は論理的に理詰めが出来るよ、とアピールしたらいかがでしょう。 もう抗体のせいだね、と認められたら貴方は一人前。 それもせず、抗体が悪い！買い替えさせてくれ！と言われても、貴方が教授に抱いた全く同じ感情を教授も抱くでしょう。 「今年の学生もその程度か」と。

(無題) 削除/引用 No.7404-5 - 2018/11/14 (水) 19:38:25 - AA 非常に残念ながら、そういう先生/研究室の話は割とよく耳にします。 社会的な視点からは許容できることではないですが、 反面、個人として出来うることは殆どないと思います。 (教授が急に改心することもないでしょうし、違う先生に入れ替わったりもしません。) どんな人間性の人であったとしても、必ず2,3は学べる点があるはずですので そういった点は学びつつも、必要な対応(研究室変更など)を取るしか無いですね。 ちなみに論点からそれますが、主原因が自分の外にあったとしても 手技に全く問題がないケースもレアだと思いますので 自分の手技は常に疑うべきだと思います。 頑なな上司がいると、つい自分の主張にこだわってしまいますが、 そんなときこそ一旦冷静になることも大事です。

(無題) 削除/引用 No.7404-4 - 2018/11/14 (水) 19:22:56 - R 予算の無いなかで、どのようにしたら解決できるかを 提案されたらと思います。 お金かけること前提の提案されても、 無い袖は振れません。 費用対効果は説得材料になるかも知れません。 この場合の効果は、研究全体の中で戦術的ではなく戦略的な意味で。 (広くは教室全体にとってお金をかけるに値するか)

(無題) 削除/引用 No.7404-3 - 2018/11/14 (水) 19:22:44 - moz 結構ヒドイ教授だと思います。 しっかり指導するのが義務でしょう。 指導しなければ自分の業績も増えませんし、指導力がないのか？ 学部長等に伝えて、ラボを変えたら？貴重な時間を無駄にしているよ。

そんなもん 削除/引用 No.7404-2 - 2018/11/14 (水) 19:09:48 - そんなもん

大学教授ってこんなもの？ 削除/引用 No.7404-1 - 2018/11/14 (水) 17:58:53 - あんさ 生物系大学院生のものです。 研究を始めて数年経ちましたが、未だこの業界の普通がわからず 絶望しかけているので教えてください。 私のラボは学生は私1人、テクニシャン1人、教員3人と人数が少なく 予算も少ないラボです。また、教授と下2人の先生は仲が悪く、 研究に対しても獲得した研究費に対してもそれぞれ全っく関与しあっていません。 今は私しかいませんが、研究室に入った学生は全て教授が囲っています。 私や、テクニシャンの方は教授から実験、研究の指導を受けていますが、 教授はとても忙しく、指導を受けること自体がほぼなく野放し？にされている状態です。 その中でも書籍や論文、学会で色々な方と話したり、私のラボのした2人の先生方（教授の手前2人が積極的に指導をしてくれることはありません。）のアドバイスから、研究の組み立て方、実験のやり方等、必死で学んいる最中です。 前置きが長くなりましたが 例えば実験がうまくいかない時に 予備実験により実験のどの段階でトラブルが生じているかをデータで示しつつ、 その原因が、試薬Aの劣化が原因である可能性が高いため、買い直して欲しい ということを教授に伝えるとします。 そうすると、ほぼ100%「そんなことはありえない」と断言され、怒られます。 お前のテクニックに問題があるからうまくいかないのだと。 根気よく何度もその件を伝えると、なんとか試薬Aを買ってもらえるという状況です。 また、私の研究室では、どの抗体もかなり非特異的な結合が多く、どのバンドが目的タンパク質なのかがわからない状態です。また抗体は1タンパクにつき、1つしかなく、ポジティブコントロールやネガティブコントロールもありません。 そのため、分子量のみを判断材料に目的タンパク質を特定しています。 教授に現状を話し、ウェスタンのバンドの特定のためポジコンとして目的タンパク質の阻害剤の購入を求めたところ、それが本当にポジコンとして機能するかわからないため購入できないと言われました。また阻害剤だけではなく、リガンドとなるタンパク質やベクター、抗体の買い直しもお金がかかるためできないとのことです。 それよりもwashing の回数を増やす等の努力をしてくれと言われました。 研究室ってこんなもんでしょうか。 また皆さんどうやって上司を説得しているのでしょうか。 ちなみに教授の反応は、研究室のOB•OGの方も同じ悩みを持っていたそうで、私に限ったことではないと断言できます。

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