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(無題) 削除/引用 No.7399-14 - 2018/11/14 (水) 04:16:49 - おお >プールに例えると, 泳いでる人の数と, 個人が肌で感じる塩素濃度は無関係ですね！ 実験でたとえ的な話をするとウエスタンブロットで１５レーン転写したメンブレンも２レーン分だけきってほぼ七分の一の広さのメンブレンも同じ抗体濃度でIncubationするとおもいます。メンブレンが広いからと言って濃度を上げることはしませんし、上げるとノンスペが上がる可能性が高い。メンブレンを細胞に置き換えて考えたらいいのかなとおもいます。

コメントありがとうございます 削除/引用 No.7399-13 - 2018/11/14 (水) 01:40:38 - ひー @抗体会社の中の人様 FACSの染色結果を最も左右するのは抗体の濃度であって, 細胞数に応じた量の調整は原則不要ということなのですね. 最終的な溶液の量を100uLとして計算すると, メーカー記載の希釈率は 1:80~1:20 ということになりました. asan様のコメントも参考に, 1:25 / 1:50 / 1:100 / 1:200 / 1:400 の各条件でtitrationを試してみようと思います. @Mac様 細胞数があまりに多すぎると染色のintensityが下がる可能性があり, 一方IL-23Rのようにターゲットの発現量が少ない場合には細胞数が多くても (多い方が?) 検出できるかも知れないのですね. @ナチョ様 おっしゃる通りターゲットが少ないのに抗体の量も減らしてしまうと検出できなくなるように思ったのですが, メーカーの表記と同僚の言葉に混乱してしまってこちらに助けを求めました. @おお様 >>抗体濃度が一定なら、一つの細胞を取り囲む抗体濃度が一定 プールに例えると, 泳いでる人の数と, 個人が肌で感じる塩素濃度は無関係ですね！(塩素が充分な量あれば) お陰様でスッキリしました.

(無題) 削除/引用 No.7399-12 - 2018/11/13 (火) 22:17:56 - おお 詳しいことは知らないものだけど、皆さんのコメントで理解が深まります。 細胞の数ベースで抗体量をということですが、そうすると細胞あたりのターゲットの分子の数が多い少ないを考慮しないといけないかとか、あまり現実性がない話にもなってしまうような気がします。 おそらく細胞あたりの濃度というのはバックグランド（ノンすぺ）があがらない濃度ということかなと思います。また抗体濃度が一定なら、一つの細胞を取り囲む抗体濃度が一定なので、ターゲットの量に対して過剰ならシグナルもバックグランドも細胞数にあまり依存しないという理屈は成り立つと思います。

(無題) 削除/引用 No.7399-11 - 2018/11/13 (火) 20:09:27 - 標準プロトコル 質問者さんの情報から目的抗体はR & D Systemsのものと推測されますが、R & D Systemsの標準FACSプロトコル（IL23R抗体の染色例のレジェンドにリンクあり）RT染色なんですよね。 キャッピング and/or エンドサイトーシスは昔は警戒されてましたが、実はそれほど問題にならないというのが最近は多数になってきています。FACS staining bufferにはアザイドも入っていてATP-dependentな機構は一応止めていることになっています。そのため、エンドサイトーシスも抗体によるシグナル入力あるいは阻害もほとんどの場合影響ないのでは？ もちろんものにもよるだろうし、用心しすぎて悪いことではないですが。

(無題) 削除/引用 No.7399-9 - 2018/11/13 (火) 18:37:18 - Mac 固定していない細胞で、細胞表面抗原をフローサイトで検出する場合、室温で大丈夫かどうかはon iceと比較してから判断した方が無難と思います。室温だと、抗原によっては細胞表面と細胞質の間での移動（エンドサイトーシスなど）により染色レベルが影響される可能性があります。また、標的が受容体の場合、抗体結合がアゴニストあるいはアンタゴニストとして作用する可能性もあり、室温だと抗体結合により、その受容体の発現も含めた表現形も変化する可能性があります。 細胞数を一定にして染色しているわけではない（サンプルによっては十分な数の細胞が取れない場合もあるので）ですが、細胞数を増やしすぎて染色のintensityが下がってしまった経験があるので、不必要に細胞数を増やさないようにしています。5.0*10^6 個のマウス脾細胞を0.1mlのボリュームで染色するのであれば、まず大丈夫とは思いますが、それ以上には増やさない方がいいかもしれません。ただし、一般論として、サイトカイン受容体の細胞表面発現量は低いですので、IL-23Rの場合はさらに細胞数を増やしても行けるかもしれません。何らかの事情で細胞数を増やす必要がある場合は、予備実験をした方がいいかもしれませんね。

分子間の反応考えたら分かるでしょ 削除/引用 No.7399-8 - 2018/11/13 (火) 16:39:02 - ナチョ 中の人が説明してくれましたが、 ターゲット細胞(の割合)が1％と少ないからと、抗体添加量(濃度)を1/100に減量してしまったら、反応が平衡に達するまでの時間が100倍になって(例えば10分→1000分)しまうから、悪手だって分かるでしょ、 温度も4℃に冷やしたら反応速度が遅くなってしまうし。

(無題) 削除/引用 No.7399-7 - 2018/11/13 (火) 15:08:52 - 抗体屋 ちなみに、今はFACS染色は（4℃でなく）RTですると記述する抗体会社の標準プロトコルも多い。4℃ではダメというわけではなく、RTでも問題ないよ、という意味だが、当の抗体会社の社内検定もRTで染めているわけで、そこの会社の抗体はRTで染めた方が無難ともいえる。 4℃派の理由ももっともだからいいけど、培養細胞などは4℃に置いておくよりもRTの方が死んでいくスピードが遅いケースも多いのは記しておきたい。

(無題) 削除/引用 No.7399-6 - 2018/11/13 (火) 15:02:07 - canto >>抗体会社の中の人さん "10^6 cells染めるのにxx ugなら、10^8 cells染めるから100倍"理論を強く主張されたことがあります。 容量を少なくして 10^6 cell/0.1uL抗体/10μL buffer 10^7 cell/1uL抗体/100μL bufferとかやってました。 やっぱこれおかしいですよね。よかった。

(無題) 削除/引用 No.7399-5 - 2018/11/13 (火) 14:49:36 - canto 細胞を回収、カウント ↓1*10^6個ずつエッペンに移す ↓遠心、上清を除く ↓染色用bufferで希釈した抗体溶液を50μL加える ↓on ice でインキュベート ↓1mLのbufferを加える ↓遠心、上清を除く 解析用のbafferを加え解析 と日頃やってると質問内容が意味わからない。

(無題) 削除/引用 No.7399-4 - 2018/11/13 (火) 14:44:49 - 抗体会社の中の人 FACS染色で重要なファクターは実は濃度のみ。染める細胞数やvolumeは大きななファクターではない。 FACS用抗体を出しているメーカーのTDSにはxx ug for 10^6 cellsみたいに書いてあるが、実はそれらのメーカーの標準プロトコルを見ると100 ulで染めることになっている（全血染色では異なってたりもするが…）。濃度が重要なので、50 ulにすれば必要な抗体は半分で済むことになる。ただし、細胞洗浄時に、細胞ペレット・チューブからの残り液の持ち込みがそれなりにあるので、volumeを減らすとチューブごとに実濃度のブレが起きやすいので注意。 10^6 cells染めるのにxx ugなら、10^8 cells染めるから100倍で・・・、とする人は少なからずいる（留学先のラボ周辺でよくみた）が、これはまことに無駄遣い。初めにこのような表記をしたPharMingenの罪だね。 良心的な表現をTDSにしてくれているはThermoのeBioブランド。10^5〜10^8 cells染めるのにxx ugと書いてくれている。要は（染めるvolumeが同じであれば）細胞数で抗体量を変える必要はないということ。ましてや、ターゲット細胞の割合が何%とかは関係ない。 あと、xx ug必要というのの判定点の基準は会社によりまちまちと考えた方がいい。同じクローンでもeBioのsuggestionはBioLegendより低いことが多い。別にeBioがより品質がいいというわけではない。 結局は、titrationは自分でして決めるのがいいし、メーカーもそうしろと書いている。でも、単発で染めるだけとかで手間を取りたくなければ、安全を取って多めになっているかもしれないけど、メーカーのsuggestionに従っておけばよい。

(無題) 削除/引用 No.7399-3 - 2018/11/13 (火) 13:11:54 - ひー asan様 早速コメントありがとうございます. 充分と思われる量の抗体を使用して, ある程度経験的に決めていくのですね. >>1/50-1/500ぐらいの範囲 これは抗体のバッファに対する希釈率(体積/体積)ということでしょうか? また, 1ウェルあたりに播く細胞数の常識的な量(数および濃度)なども, 目安があれば教えて頂けませんでしょうか

(無題) 削除/引用 No.7399-2 - 2018/11/13 (火) 09:40:03 - asan 普通は抗体高原反応は過剰量の抗体が存在する事を前提に反応させるため、あまり厳密に定量的な条件を設定しないことが多いです。 多くの実験では厳密全て最適化するのは大変なので、多分1/50-1/500ぐらいの範囲でバックグラウンドが出なくて問題ない条件を採用してる人が大多数だと思います。 FCSで重要なのはネガコンをとってS/N比でポジティブとネガティブをどこに設定するかです。 極端に少なくなければ大丈夫です。ま、tubeの吸着とか、混入してくる細胞腫やバッファーの組成によっても 変わってくることもあるので、特に理由がないならば際どいところでは実験は組まない方が良いです。

フローサイトメトリの抗体希釈濃度の決め方 削除/引用 No.7399-1 - 2018/11/13 (火) 07:30:33 - ひー お世話になります. FCM実験を始めたばかりの初心者です. あるT細胞表面抗原 (IL-23R) の抗体を購入するにあたり, メーカーのホームページに「0.25 - 1 ug / 10^6 cells」と推奨使用濃度の記載がありました. (ちなみに販売ロットの濃度は0.2mg/mL) これは文字通り「1,000,000個のIL-23R陽性細胞を染めるのに絶対量として0.25ug (~1ug) の抗体があれば良い」と捉えて良いのでしょうか?? 例えば, 培養プレートのウェルに 5.0*10^6 個の脾細胞を加えた場合, そのうちT細胞が3割ほど(1.5*10^6 個)で, そのうち5%ほど(7.5*10^4 個)がガンマデルタT細胞で, さらにその半数にIL-23Rが発現 (3.75*10^4 個)していると仮定すると, 抗体の推奨使用量はナノグラムオーダーになってしまいます... メーカー推奨の濃度を基準にして段階希釈を行う予定ではあるのですが, 最初の濃度の決め方に自信が無く困っています. 実験に詳しい同僚(フランス人)に何度か質問したのですが, 私の英語力・理解力が乏しく解決しませんでした. 基本的な質問で恐縮ですが, なにとぞご助言頂けましたら幸いです.

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