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(無題) 削除/引用 No.7394-18 - 2018/11/18 (日) 12:20:14 - AP >必要なコロニー数は３００以上なので、IPTG誘導の時間を２時間程度に伸ばします。確実に、遺伝子誘導をかけ、コロニーを得るためです。 独立したクローンが300以上必要ならば、誘導時間を伸ばすのは問題があります。 その間に分裂して単一クローンが複数のコロニーを生じるからです。そういうこともあって、回復培養は一般に45ー60分というふうになってるんじゃないかと思います。 スケールを上げて数を稼ぐか、IPTG誘導であればIPTG濃度を上げるという手もあるかと思います。発現が弱い細胞も生やすためにカナマイシンの濃度を適度に下げてみるのもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.7394-17 - 2018/11/18 (日) 09:23:06 - mon コロニーの少ない〜取れない理由に (1)薬剤耐性遺伝子と逆向きの転写産物が薬剤耐性遺伝子領域も含み二重鎖RNAを形成する、 (2)薬剤耐性遺伝子の転写が、プラスミド複製領域まで続きその機能を阻害する、なども考えられます。 どちらも(両方向に働く）転写ターミネーターも繋げば防げます。

一応コロニー取れました 削除/引用 No.7394-16 - 2018/11/18 (日) 06:52:45 - タンパク カナマイシン耐性遺伝子で一応コロニー取れましたが、プレートあたり２０個程度。他の組み換えの１０％以下です。 短い遺伝子のゼオ耐性はまたもやゼロでした。こっちはギブアップ。 将来はスクリーニングを予定しており、必要なコロニー数は３００以上なので、IPTG誘導の時間を２時間程度に伸ばします。確実に、遺伝子誘導をかけ、コロニーを得るためです。 コンピタントを調整し直す、あるいは新規に購入することも考えます。 可能性が出てきました。ご助言、ありがとうございます。 次は大腸菌のプロモーターを探します。すでにLac, arabinoseは使っております。追加で発現誘導するには何が良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7394-15 - 2018/11/13 (火) 09:38:18 - AP あとプラスミドのコピー数の問題もあるかも。 発現系が特殊なので、どの程度、当てはまるかわからないけれど、ハイコピーとローコピーで適した抗生物質の濃度が倍くらい違う。カナマイシンなんかはラボ毎、実験ごとにタイトレーションしてちょうどいい濃度を決めていたりする。 アンピシリンの場合も回復培養が全く意味がないわけじゃなくて、やったほうが数割、形質転換効率が良くなる。やらないからゼロということにはならないけど。

ありがとうございます 削除/引用 No.7394-14 - 2018/11/13 (火) 08:02:32 - タンパク ありがとうございます。 まずは　IPTGで誘導をかけ、インキュベーションし、KM, zeoでやってみます。 ご助言、感謝申し上げます。ダメだったら、KM耐性プラスミドからエピトープライブラリーを作成し、スクリーニングしてみます。 以前、ABPC耐性でも、同様の結果でした。（ABPCでは誘導時間が少なくても、うまくいくと聞いていますが、コロニーゼロでした） ポジコンのKM耐性プラスミドについては、ライゲーション付きでもコロニー数百はできています。 通常の遺伝子組換えは年数十回やっており（週1〜２回程度）、2〜3キロのフラグメントであれば、うまくいくことが多いです。３流ラボではあるものの、「まあ、やってます」と言える状況です。

(無題) 削除/引用 No.7394-13 - 2018/11/12 (月) 12:24:45 - AP Zeocinを使うとき塩濃度を下がる必要があるのは、イオン強度が高すぎると「効きにくくなる」ためですね。コロニーが生えてこない理由には当たらない。

(無題) 削除/引用 No.7394-12 - 2018/11/12 (月) 09:11:31 - asan ゼオシンはlow salt LBとかを使う必要があったと思いますが、それが原因かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7394-11 - 2018/11/11 (日) 18:50:09 - AP となれば失敗は当然の帰結ですね。 カナマイシンなどタンパク質合成を阻害する抗生物質でセレクションをかける場合、アンピシリンなんかと違って、形質転換の後の回復培養を1時間程度は取ってあらかじめ耐性遺伝子を発現させておく必要があります。いきなり選択培地に蒔いたら、耐性遺伝子からのタンパク質も発現されないことになってしまい、耐性を得ることもできません。 LacP誘導系なら、回復培養の時にIPTGを入れておく必要がありますね。

(無題) 削除/引用 No.7394-9 - 2018/11/11 (日) 17:23:34 - mon > IPTGはプレートにカナマイシンとともに、最初から入れています。 > 従いまして、IPTG誘導をかけずにまいている状況です。（誘導かけたほうが良いかもしれません） 誘導をかけた方がよいでしょう。ポジコンとしてカナマイシン耐性遺伝子を発現するplasmidを導入して、誘導なしで撒いてみれば。

ありがとうございます。 削除/引用 No.7394-8 - 2018/11/11 (日) 16:31:20 - タンパク SD配列に近いものは入っております。 EGFPでは発現を確認しています。従いまして、プロモーター周辺は「それなりにうまくいっているのでは」と思いますが、、、（自信ありません。） IPTGはプレートにカナマイシンとともに、最初から入れています。 従いまして、IPTG誘導をかけずにまいている状況です。（誘導かけたほうが良いかもしれません） 他の遺伝子組換えが１００以上のコロニーが出る状況で、コロニーが出ない状況です。「なかなか手強い」感触です。

ありがとうございます。 削除/引用 No.7394-7 - 2018/11/11 (日) 16:22:00 - タンパク

(無題) 削除/引用 No.7394-6 - 2018/11/11 (日) 14:14:03 - mon なお、lac promoterはかなりleakyなので、pUC系の多コピープラスミドではグルコースを入れても（抑制状態でも）遺伝子発現が観察できます。 より厳密な発現制御したいなら、p15A系やpBR系のlow コピープラスミドを使う（+LacIq)か、Tetracycline制御promoterをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.7394-5 - 2018/11/11 (日) 12:09:57 - mon タンパクコード領域だけでなくRBS（SD配列）もいれていますか？

(無題) 削除/引用 No.7394-4 - 2018/11/11 (日) 09:41:16 - AP どのタイミングでIPTGの誘導をかけているんですか？ 選択培地に蒔く前？

ありがとうございます。 削除/引用 No.7394-3 - 2018/11/11 (日) 09:27:38 - タンパク プロモーターはlac系です。 カナマイシン耐性遺伝子はplasmidからORFをPCRで増幅しました。 transformationは普通のコンピタントです（井上法）。だいたい10の７乗程度の効率です。遺伝子組み替えに関しては、ほぼ毎週やっている状況です。 IPTGで誘導したのですが、誘導がかかる前にカナマイシンの静菌作用でコロニーができないという可能性も考えましたが、以前やってみたアンピシリン耐性遺伝子でもダメだったので、別の理由と推測しています。 カナマイシン耐性遺伝子を有するplasmidからランダムに遺伝子を取り出し（例えば平滑末端に切る酵素の部分切断）、発現ベクターに入れてアンピシリン＋カナマイシン両耐性でスクリーニングすることも考えています。plasmidの基礎的知識（どうして抗生剤に耐性になるのか、耐性遺伝子の発現など）が、不足しているので、難儀しております。代わりに使ったGFPではうまくいきましたが、できれば抗生剤で選択をしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7394-2 - 2018/11/11 (日) 06:59:45 - おお いっぱいチェックポイントがあります。大まかに書いても プラスミドのデザイン Constructionの手技 Transformationの手技 最初の項目以外はありえる問題点に対してポジコンをおけば解決の糸口がつかめるはずです。

カナマイシン耐性遺伝子 削除/引用 No.7394-1 - 2018/11/11 (日) 05:50:23 - タンパク カナマイシン耐性遺伝子を大腸菌で発現しようと考えました。 遺伝子をPCR で増幅し、発現ベクターへ入れましたが、カナマイシン耐性のコロニーは取れませんでした。同様にゼオシン耐性遺伝子でもやりましたが、ダメでした。 どうすればいいのでしょうか？ご教示お願いいたします。

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