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(無題) 削除/引用 No.7369-9 - 2018/11/03 (土) 04:30:20 - gPCR みなさま、なんとか方向性が定まりました。 まず、今の時点のPCR産物をダイレクトシークエンスして、ジェノタイプを明らかにします。 その上で、ホモのマウスが見つかればそのゲノムをコントロールにして、アニール温度をあげたり等最適化をすることにします。 みなさま、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7369-8 - 2018/11/02 (金) 17:00:26 - おお それか、そのIndelが入っているか入ってないかで制限酵素認識部位ができたりなくなったりしてないか？４ベースカッターとかでもいいので。

(無題) 削除/引用 No.7369-7 - 2018/11/02 (金) 15:19:20 - SYBR master primerの3’末端の1塩基の違いだけでは、PCRは走ることが良くあります。 例えば、primerの3末3塩基がGAG-3’で鋳型の方が、NCC-5’であった場合、 primerのAは無視されてと言うより、たぶん折れ曲がって走ったりします。 この折れ曲がりは、primerだけで無く鋳型の方でも起きますので primerによるselective-PCRをやっていると、これらのデータは結構な頻度で見受けられます。 これを防ぐためには、 1. アニールの温度を上げる もしくは 2. primerの濃度を段階的に下げていく、 (primer濃度が下がると実効Tmが上がりますので、アニールの温度を上げたのと同じ効果があります。私は最近こちらを使います。） で解消できるときもありますが、可能な限り2塩基以上の違いで、 primerもしくは鋳型が折れ曲がってもアニールしないように設計すれば 望まない状態のPCR産物を得ることが防げます。

(無題) 削除/引用 No.7369-6 - 2018/11/02 (金) 15:11:11 - gPCR おお様、AP様、コメントありがとうございます。 数塩基の違いを分離することができるとは知りませんで、調べたところCRISPR-Cas9で作製したマウスのgenotyping PCRをPAGEで行なっている論文を見つけました。 すごいですね・・・たった2塩基でも分離できるとは知りませんでした。 おそらく昔のDNAシーケンシングではこのようにして配列解析されていたんでしょうね。 ありがとうございます。これで一度検討してみます。 nature.com/articles/srep06420#f3 ちなみにPCRのサイズは、WTが349 bp、2つのラインのPCR産物のサイズはそれぞれ347、343 bpです。 この違いをPAGEでは分離できるのでしょうか？ 自家調製Taqがどのようなものかはわかりません。 -20度の冷凍庫に30本ほどのTaqチューブが1 mlほどずつ分注されており、このバッチをもう何十年も使用しているようです。ただ、組換えのTaqもあることはあるので、それでhomoなのにも関わらずWTのサイズのbandがでるかどうかを確認してみます。 プライマーもPAGE精製を試してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7369-5 - 2018/11/02 (金) 14:26:28 - AP home madeの酵素というのが一つ怪しい。 exonuclease活性を持つ他の酵素が完全に排除できているか？ 熱処理だけで、タグつけてアフィニティー精製とまではやってないんじゃないですか？ それとオリゴヌクレオチドの合成はヌクレオチドが100%重合されていくわけではなく、1-2塩基飛ばされた産物が混じってくる。精製のグレードによりどの程度排除できるかが違うので、精製に金をかけてみてはいかが？ あるいはPAGE精製は安く自前でできるし効果が高いです。 もっとも3'側は合成開始端なのでエラーは起こらなそうですが。 SNPなんかのタイピングで、SNPをあえて3'から2塩基目とか3塩基目にするとなにかメリットがあるという話を聞いたことがありますが、詳細は忘れた。

(無題) 削除/引用 No.7369-4 - 2018/11/02 (金) 13:26:04 - おお プライマーの品質（精度）が悪い可能性。PAGE精製グレードなどでやってみる。 いっそのことすべて増やせるプライマーでPAGEでサイズを見たほうが早いんじゃないか。数ベースなら丁寧にやれば分離可能だし。ポジコンの配列がほしいところではありますけど。

(無題) 削除/引用 No.7369-3 - 2018/11/02 (金) 12:55:11 - gPCR AP様、ありがとうございます。 自家調製したTaq polymeraseを使用していますので、校正活性はないはずです。 5'-AAA.......AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' 3'-gTTTTTTTTTTT-5' こういった3’にミスマッチがあるといくら5’が相同であってもPCRはかからないと考えて差し支えないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7369-2 - 2018/11/02 (金) 11:17:05 - AP proof reading活性がある酵素を使っていませんか？

CRISPR/Cas9で作製されたマウスのジェノタイピングPCR 削除/引用 No.7369-1 - 2018/11/02 (金) 09:23:15 - gPCR 初めて投稿させてもらいます。 私の研究室にてCRISPR/Cas9で作製されたある遺伝子の欠損マウスが2ラインあります。 一つはコーディングシークエンスに5塩基の欠失、もう一つは4塩基の欠失です。 作製は受託で、ヘテロのマウスを作製まで行ってもらいました。 ジェノタイプPCR用のプライマーセット（共通のFwd、WT用のRev、del5用のRev、del4用のRevの4つです。）もそこで設計してもらいました。 ただ、報告書には但し書きが書かれてありまして、WT用のRevが必ずしもdel5やdel4のアリルを増やさないかまでは、ホモを得られる前に納品するため、確実ではないとありました。 それを心に留め、納品後にブリーディングを行なっていますが、一向にホモが得られません。 これまでに10匹のパップスが産まれていますが、PCRの結果からWTとヘテロだけが産まれています。 このマウスは2003年にすでにグローバルなノックアウトマウスが作製されており、ほぼ表現型がないとありますので、おそらく胎生致死ではなく、WT用のRevプライマーが変異のアリルも増幅してしまっているのではと考えています。 そこで納品書のプライマーの場所を確認し、自分でも作製してみようかと思いましたが、受託先で設計されたプライマーの場所は私でもここに設計するだろうと思えるほど、問題のない場所で、じゃあなぜこのWT用のRevプライマーが変異アリルを増幅してしまうのだろう...と思ってしまいました。 リバースプライマーの3’が、変異アリルにはアニールしないにも関わらず、PCRは増幅するでしょうか？ アニール温度は60度です。上昇させることで非特異的バンドは抑えられるでしょうか？ もちろん全てが本当にヘテロだという可能性はありますが、一般的に数塩基程度のインデル変異でも特異的なプライマーは作製可能でしょうか？

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