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(無題) 削除/引用 No.7366-9 - 2018/11/02 (金) 11:51:48 - ウェスタン初心者 あsdりさん、メッセージありがとうございます。 ＞可溶化の方法を変えて（易可溶性用→普通用→難溶性用）段階的に蛋白質を分画、抽出する 収縮タンパクの多さのせいかなと漠然と考えていながら、「とにかく全部溶かさなきゃ」ということに固執して段階的に分画抽出するという考えに至りませんでした。 目から鱗の気分です。 方法を調べてやってみます。

(無題) 削除/引用 No.7366-8 - 2018/11/02 (金) 11:07:26 - あsdり ウェスタンが難しい組織というより、単にアクチンとミオシンとその他その関連蛋白質がかなりの割合を占めるために、一定の組織蛋白質量あたりでみると、相対的に量の少ない蛋白質の検出がしにくいのです。可溶化の方法を変えて（易可溶性用→普通用→難溶性用）段階的に蛋白質を分画、抽出するとか、することで、各々分画試料中の対象蛋白質の相対的存在量を増す（濃縮の効果）とか工夫すれば解決する場合が多いです。もちろん分画の過程で手技的なことで差が出ないように、比較すべきサンプルでは同時に実施するとかは注意は必要かもしれなですが。 SDSや高濃度尿素含有bufferだと、多くの難溶性蛋白質も含めてたいていの蛋白質が抽出されますので、``全蛋白質をもれなく調べる``という点では優れていますが、上記のような欠点もあります。目的や事情の応じてlysis bufferを上手に選択することはけっこう重要です。

投稿者名が・・・ 削除/引用 No.7366-7 - 2018/11/02 (金) 10:06:39 - ウェスタン初心者 No.7366-6は前の投稿のになってました・・・お恥ずかしい。 申し訳ないです。

(無題) 削除/引用 No.7366-6 - 2018/11/02 (金) 09:28:15 - タンパク抽出初心者 qqさん、メッセージありがとうございます。 膜はPVDFを使っています。 ＞速筋だけ110kDaに大きなバンドがあったりしませんでしょうか？ というのは、速筋だけ110kDaのところに別の多量のタンパク質があって目的タンパク質がマスク？されている可能性があるかもしれないということですよね？ 転写後の膜はまだ残してあるので、CBBあたりで染色してみます。 ＞その文献の著者に質問するのが一番ではある。 ごもっともです・・・

(無題) 削除/引用 No.7366-5 - 2018/11/02 (金) 09:15:16 - ウェスタン初心者 おおさん、メッセージありがとうございます。 ＞目的タンパク質の文献上で証明 というのは、ウェスタンブロットで速筋を使って発現を確認している論文が存在し、速筋で顕著に発現量が低いとかそういうことはない、という意味でした。 収縮タンパクが悪さしてるのかなぁと思いつつ、速筋だけというのがどうにも解せなくて・・・ Lysateは当初 1% SDSでやって良くなかったので、8M Ureaに変えて改善が見られたのでUreaを使ってます。 ＞サンプルバッファーでボイリングしたときにあぐって ボイルが悪さをするという記述は方法を探しているときにいくつか見かけましたが、RTで30分とか4℃でovernightとか試してみるしかないですかね・・・ しかし試薬も時間もちょっと消費しすぎていて立場上気まずくなってきているので、経験者のお知恵を貸していただけたらと思って投稿した次第です。

(無題) 削除/引用 No.7366-4 - 2018/11/02 (金) 09:13:12 - qq 検出した後のPVDF(?)膜か、転写していないゲルをタンパク染色してみましたか？ タンパク量はそれなりにそろっているでしょうか？ 速筋だけ110kDaに大きなバンドがあったりしませんでしょうか？ ＞目的タンパク質が速筋にも発現していることは文献上で証明されています。 というのは、ウェスタンで検出しているということですか？そうであれば、その文献の著者に質問するのが一番ではある。それともメッセージであれば、証明されているということにはならない気がします。

(無題) 削除/引用 No.7366-3 - 2018/11/02 (金) 06:32:50 - おお サンプルバッファーでボイリングしたときにあぐって１８０とか高分子に来るとか？それが速筋で顕著なのかも。 また速筋ではインターナルコントロールも弱いのなら蛋白の溶出がうまく行ってないかも。Lysatesの作り方を改善したほうがいいかもしれない。 ＞ちなみに目的タンパク質が速筋にも発現していることは文献上で証明 どのようにして？ 抗体の種類によっても検出されたりされなかったりするのでそういうところもかんがえないといけないかもしれない

追記 削除/引用 No.7366-2 - 2018/11/01 (木) 13:17:09 - ウェスタン初心者 ローディングコントロールとしてβ-tubulinを使用していますが、そちらは速筋で若干薄いものの検出できています。

速筋・遅筋のウェスタンブロット 削除/引用 No.7366-1 - 2018/11/01 (木) 13:07:27 - ウェスタン初心者 いつも勉強させていただいております。 ウェスタンブロット初心者なのですが、問題が発生して困っています。 マウス骨格筋、脳、肝臓、心臓でとある目的タンパク質（110kDa付近）を検出しようとしているのですが、速筋（前脛骨筋や腓腹筋など）でのみバンドが見られません。 メンブレンの状態としましては、遅筋（ヒラメ筋）や他の組織では目的タンパク質のバンドと非特異のバンドが見えていて、速筋を流したレーンだけ、おおよそ180kDa付近に泳動方向に対して凹型の濃いバンドが出て目的部分は真っ白、80kDa付近に濃い2本のバンド（これは遅筋および他の組織と共通）という感じです。 180kDa付近のバンドは遅筋でも見えてますが他の組織にはありません。 レーンあたりのタンパク量は20ugでしたが、濃すぎるのかと思って10ugにしてみましたがそのまま薄くなっただけでやはり目的タンパク質が速筋だけ見えない状態です。 さらにアプライ量を減らしてもよいかもしれませんが、10ugで他の組織も結構見づらいので避けたいところです。 ちなみに目的タンパク質が速筋にも発現していることは文献上で証明されています。 骨格筋のウェスタンは難しいとは聞いていましたが・・・上記のような状態の解決方法についてご教授いただけたらと思います。 よろしくお願いします。

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