どっちでもいいですが、一般的にin solutionでやるものをbatch法、カラムなどに充填させて反応させる方法をフロースルー法などと言います。in solutionの方が時間がかかるのと以外かはわかりませんがflowthoghの方がはるかに結合がよいことが多いですが（おそらく相互作用の確率の問題）、充填してすぐにスピンすると完全に回収で着ないかもしれないです。また、in vitroでのprotein-protein回収をするのは結構難しいので、胎児lysates由来で回収するならタグ付き淡白のtgマウスを作製してやる方が一般的です。
あなたのような方法は一般的にはGST-pulldownという形のやり方で、反応後precisin protease等で切断後溶出する方法があります。
MS解析に持ちこむ場合は、IgGの持ち込みやdetergentの有無など色々注意点もあるので、できれば早めに測定するファシリティーか共同研究者と相談の上その人が良いと思うやり方を踏襲するのがいいと思います。バックグラウンドや結合タンパク質が少ない場合は銀染色せずにon beadsで消化したり直接酸などで溶出後にダイレクトにLCMSをする方法がロスが少ないですが、回収して銀染色をして切り出して消化後解析の方がいいかもしれませんね。mlオーダーで溶出した場合はアセトン沈殿などで濃縮とバッファーの組成を整えてからSDS-pageすればいいです。
コンジュゲートが共有結合でされてるならば熱溶出後にIgG等の持ち込みが減るのでその方がいいですが、SDS-Pageをするならどっちでもいいかもしれないですね。 |
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