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解決しました 削除/引用 No.7358-9 - 2018/10/30 (火) 15:26:05 - タンパク抽出初心者 本日、チオ尿素を除いたLysis bufferを新しく作り直してみたところ、異常な紫色になることもなく（恐らく）正常に吸光度を測定することができました。 切羽詰まっていたがために単純な見落としをしてしまいましたが、こちらに相談することで落ち着くことができたように思います。 このサンプルから目的タンパク質がきちんと検出できるかどうかはまた別問題のような気もしますが。。。 メッセージを下さった ppp様、ふみ様、TS様、おお様、ありがとうございました。 スタンダードについては先人が残していったストックを使ってと言われて何の疑問にも思わず使用していましたが、尿素を使った抽出はうちでは自分が初めてですし、改めてスタンダード測定もイチから自分でやってみます。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7358-8 - 2018/10/30 (火) 12:37:41 - TS とりあえず次に使うつもりのバッファーでスタンダード測定してみようね。

メッセージありがとうございます。 削除/引用 No.7358-7 - 2018/10/30 (火) 10:05:15 - タンパク抽出初心者 皆様ありがとうございます。 TS様のおっしゃる通り、Lysis bufferのみでもすぐに濃い紫に変色してしまいます。 むしろ筋を溶かした溶液のほうが吸光度が低くなります。 改めて使っているキットの説明（Thermo）を見直したところ、確かにチオ尿素はcompatibility tableでn/aとなっていました。 完全に見落としていました。 抽出方法を探している中で、尿素単独よりもチオ尿素を加えたほうが良いという話をいくつか見かけたので組み合わせて使ってみたのですが、一旦チオ尿素なしでやってみようと思います。 またご報告に来ます。

(無題) 削除/引用 No.7358-6 - 2018/10/30 (火) 04:59:17 - おお https://www.funakoshi.co.jp/contents/67761 対応可能な化合物および濃度 Thiourea 500 mM

(無題) 削除/引用 No.7358-5 - 2018/10/30 (火) 02:51:23 - おお https://www.biocompare.com/Product-Reviews/350989-easy-protein-assay/ It seems that Thiourea interferes with the reaction, leading to saturation.

(無題) 削除/引用 No.7358-4 - 2018/10/29 (月) 21:25:44 - TS 希釈すればできそうですが、チオウレアはBCAにコンパチブルですかね。 ピアースのテーブルを見るとチオウレアはNot testedになっていますね。 他のは大丈夫そうですが。 https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/TR0068-Protein-assay-compatibility.pdf Lysis bufferのみで青くなるってことですよね。 じゃなきゃ、pppさんがおっしゃるように濃度が高すぎなんだが。

(無題) 削除/引用 No.7358-3 - 2018/10/29 (月) 21:22:54 - ふみ もっと薄めていって希釈度と検出値が直線関係になるところを探すか、あるいは、Karlsson JOの方法で定量するのがよさそうに思います。

(無題) 削除/引用 No.7358-2 - 2018/10/29 (月) 19:52:23 - ppp タンパク質濃度が非常に濃いということはありませんか? たいていのBCA assayの試薬は2mg/mlまでしか測定できないので。 100倍希釈でダメなら、200倍、400倍ともっと段階希釈してみるとか。

尿素抽出サンプルのBCA法 削除/引用 No.7358-1 - 2018/10/29 (月) 15:24:32 - タンパク抽出初心者 いつも勉強させていただいております。 基本的なことで申し訳ありませんが、よろしくおねがいします。 マウス骨格筋組織から組織溶解溶液（7M尿素、2Mチオ尿素、3% CHAPS、 1% TritonX-100）で抽出したサンプル溶液をBCA working reagentに 加えると、入れた瞬間に濃い紫色になってしまって測定どころでは なくなってしまう（吸光度が2を超える）のですが、どうしたらよい でしょうか？ 市販のBCA working reagent 200 ulにサンプル溶液 2 ulを加えています。 試しにサンプル溶液をMilliQで100倍希釈して加えてみたり、 一度アセトン沈殿させてから2% SDS溶液で再溶解してみても駄目でした。 周囲に相談できる人がおらず、論文やオンライン上で探してみても 「できます」という風なことしか書かれておらず、自分も混乱してしまって 何か根本的なことを見落としてるんじゃないかと思い、第三者の視点を お借りしたく投稿させていただきました。 ご助言のほど、よろしくお願いいたします。

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