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(無題) 削除/引用 No.735-14 - 2012/07/14 (土) 16:53:15 - AP >原理を考えれば、ph7のH2Oを使うのは、溶出効率の観点から、 >実用的ではないことぐらい分かると思います。 ほんとかしら？　原理的に説明してみてほしいな。 純水でも実用できていますけれど。

(無題) 削除/引用 No.735-13 - 2012/07/14 (土) 16:14:32 - み >[Re:12] 教えてください。さんは書きました : > それはさん, qqさん > > コメントありがとうございます。 > 溶出の件は知ってはいたのですが、２回目のcut時のbufferを考えるとmilli Qで溶出すべきかと考えました。新しくトピックを立てさせていただきました。そこでもこのことに言及しております。 最初に１０マイクログラムも切っているのだから溶出後５０分の１でも泳動してどれくらいの収量で回収できているかチェックできるでしょう。 回収量が不十分なら操作が下手なのか、そもそもキットの性能がそれまでなのか、H2O溶出が駄目なのかは知らないけれど、スタートの量を増やすか、それとも他の切り出し精製法を適用すべきでは？ 洋土社イラストレイテッドなどに記載されているＴＥ飽和フェノールで抽出する方法ならロスは殆ど無いし、Ligationのための精製度もクリアできる。下手でもスタート量５マイクログラムで余裕なはず。 mediumからHighへ塩濃度を上げる方法が今回の酵素に適用できるかは知りません(4番Ｂｕｆｆｅｒは緩衝系が若干違ったきがするから）。しかし、それもトライしたら良いだけですよね？次の日の朝にはコロニーが出るかどうかで結果が分かる実験でしょう。

(無題) 削除/引用 No.735-12 - 2012/07/14 (土) 15:52:38 - 教えてください。 それはさん, qqさん コメントありがとうございます。 溶出の件は知ってはいたのですが、２回目のcut時のbufferを考えるとmilli Qで溶出すべきかと考えました。新しくトピックを立てさせていただきました。そこでもこのことに言及しております。 初歩的な質問で大変恐縮ですが、どうかよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.735-11 - 2012/07/14 (土) 14:53:06 - qq 注意点はたくさんあるので、トピを立てた方がよろしいです。

(無題) 削除/引用 No.735-10 - 2012/07/14 (土) 14:48:51 - それは >Qiaex II gel extraction kitにより精製しています。DNAの溶出はmilli Qを使用しています。 確かに、キットの説明書にはＨ２Ｏでもいいみたいには一見書いてはあるが、 原理を考えれば、ph7のH2Oを使うのは、溶出効率の観点から、 実用的ではないことぐらい分かると思います。 実際、キットの説明書にも、ｐＨが重要とも別の項目で詳しく書いてあります。

(無題) 削除/引用 No.735-9 - 2012/07/14 (土) 14:33:52 - 教えてください。 便乗質問させてください。 当方double digestion後のinsert量が、ligationに充分なほど回収できておりません。 みなさまのお知恵をお貸しください。 現在、Mfe1（buffer 4）で酵素処理したサンプル（10 ug）を電気泳動し、ゲルから切り出しして、Qiaex II gel extraction kitにより精製しています。DNAの溶出はmilli Qを使用しています。 その後、全量をHind3 (buffer 2)で酵素処理し、そのサンプルを電気泳動し、再度ゲルから切り出しして、Qiaex II gel extraction kitにより精製しています。 ゲル切り出しの過程でのロスが大きいようで、できれば同時にcutしたいのですが、組み合わせがよく無いようです。 みなさんに教えていただきたいのは、ロスが減らせる方法です。 下にありましたように、１回目のcut後、切り出しせずにbufferと酵素のみを補充する、だとか、エタチンのみするだとかを今回も利用できるのでしょうか？トピを立てられた方と境遇がにております。あるいは効率は低くてもMfe1とHind3の同時cutはみなさんなら行いますでしょうか？ ちなみにligationは16°CでO/Nで行い、DH5aに形質転換しています。Amp耐性であることは確認済みで、transformation効率を上げるため、タカラのligation kit ver1.2の試薬�Vも加えたりしているのですが、コロニーがでてきません。どうかみなさまのご意見伺えますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.735-8 - 2012/07/10 (火) 23:10:00 - Kei みなさん お返事が遅れてしまい大変申し訳ありませんでした。 また、トピックを立てて本当に良かったなと思っています。 研究歴は長いのですが、gene workはそれほど経験がなく、バイオイラストレイテッドで見よう見まねでやっているところです。 塩濃度に関しては全く知りませんでした。bufferの違いは塩濃度なんですね。 塩濃度が低い方で処理して、その後２つめの酵素は高い塩濃度のもので行うとのこと、非常に勉強になりました。本当にありがとうございます。自分の無知が恥ずかしいです。 >フェノール抽出に遠心も含めて３分、エタノール沈殿に遠心も含めて５分、リンスに１分、風乾に１分、しめて１０分もあれば終わる操作ではないでしょうか？ バイオイラストレイテッドでは、フェノクロ抽出に15 min, 100 % EtOH沈殿で20 min, 70 % EtOH沈殿で2 minとトータルで30 min以上はかかりそうです。。 ゲルからの切り出しは考えてみると30 minくらいはかかっていますね。。 中年さんは10 minで終えられるのですか！色んなやり方があって混乱してしまいますね。。 ですが、ゲルからの切り出しやエタ沈をせずとも、塩濃度を上げるだけで２つ目の酵素処理が出来るのは大変時間の節約になります！本当にみなさまありがとうございました！！

(無題) 削除/引用 No.735-7 - 2012/07/10 (火) 20:47:22 - み 僕もAPさんの方法でやっています。 単に塩濃度を途中から上げるだけで、精製や失活なんて行わない。

(無題) 削除/引用 No.735-6 - 2012/07/10 (火) 19:07:44 - 中年 gene workって何だか格好いいですね。 方法については皆さんお書きになっている通りで付け加えることもないのですが、当初のご質問にあった、時間的には圧倒的に２の方が早いというのは本当ですか？ フェノール抽出に遠心も含めて３分、エタノール沈殿に遠心も含めて５分、リンスに１分、風乾に１分、しめて１０分もあれば終わる操作ではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.735-5 - 2012/07/10 (火) 09:30:52 - ~ 使用する酵素の性質次第ですが、 低塩濃度の酵素で処理 必要であれば失活させる 高塩濃度のバッファーを入れる 高塩濃度の酵素で処理 でやることが多いです。 今回であれば、Age Iの方が低塩濃度で活性のある酵素で、熱により失活させることができますよね。

(無題) 削除/引用 No.735-4 - 2012/07/09 (月) 19:26:09 - HF 通常、ゲルから切出・精製を、どの方法でやっているかにもよりますが、 もしカラムで精製しているのなら、 そのカラムを用い、ＰＣＲ産物を精製するプロトコールで、 ベクターを精製することにより、バッファー交換できます。 所要時間は、５〜１０分ですね。 あとは、予算しだいですが、 NEBのAge-HFとSalI-HFを使う方法も。

(無題) 削除/引用 No.735-3 - 2012/07/09 (月) 19:18:28 - TS わたしは、だいたい２です。

(無題) 削除/引用 No.735-2 - 2012/07/09 (月) 18:59:29 - AP Age1をL buffer (塩濃度0）で消化 ↓ （65-70℃で失活。省略可） ↓ 塩を加える、または10xH bufferを加え（必要に応じてvolume-up)終濃度100 mM NaCl(Sal1だから1xHに合わせないで150 mMでもいいだろう）にしてSal1消化 たいてい、至適塩濃度が低い酵素（ここではAge1）を高塩濃度にすると、切れなくなるだけでスター活性はでない。したがって、わざわざ失活しなくても良い。 失活化する必要があるときは、第一選択は熱失活。熱失活が出来ない場合、あるいはバッファー交換を兼ねる場合、EtOH沈殿だけで大抵の制限酵素は失活するので、フェノール抽出は特別な場合を除いて必要ない（メーカーに資料があるはず）。

制限酵素処理のbuffer交換に関して 削除/引用 No.735-1 - 2012/07/09 (月) 18:38:14 - Kei お世話様です。 gene workを初めて間もない者です。 現在、vectorに遺伝子を挿入する操作を行っています。 vectorをAge1とSal1で消化したものに、両末端にそれら制限酵素配列を持たせたinsertをTA vectorからAge1とSal1で切り出し挿入しようとしています。 この時、Age1とSal1ではdouble digestionが出来ないため、sequentialに処理を計画しています。 この時のbuffer交換について教えてください。 1, Age1で処理したサンプルに飽和フェノールを加え、水層を別のチューブに取り、100 % EtOHを加えエタ沈後、70 % EtOHで再度洗って乾燥後、再溶解させ、次の酵素処理を行う 2. Age1で処理したサンプルを電気泳動し、ゲルから切出、精製後、再溶解させ、次の酵素処理を行う １と２のどちらの方法で行うのが一般的なのでしょうか？ 時間的には圧倒的に２の方が早いです。ですが、プロトコル本を見るとsequential digestionの方法は大抵１が書かれてあります。みなさん教えてください。

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