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(無題) 削除/引用 No.7340-9 - 2018/10/24 (水) 09:38:54 - 銅 multiはどうでしょう https://www.chem-agilent.com/contents.php?id=300504

(無題) 削除/引用 No.7340-8 - 2018/10/23 (火) 18:21:19 - asan >この複数のアミノ酸置換は5つでも十分対応可能ということなのでしょうか？ 3つまでOK5つでダメとかそういう単純なものでもないと思います。 個人的には、SDMは15ベーズぐらいののりしろをしっかり作るのと、メーカーが書いてるような完全なオーバラップしたプライマーではなくて少し3'側をずらすような形で設計するとうまくいくことが多いと思います。1xFLAGぐらいなら入るので、30ベースぐらいの範囲なら問題ないのではないかと思います。 うまくいかない時は、PCR酵素を変えてみるとうまく行く場合も結構あります。 ちなみにこれは厳密にはおそらくPCR反応ではないと思われます。 本当のところの仕組みは色々な説がありますが、末端のセルフアニーリングと大腸菌修復機構によるものかと思われます。

(無題) 削除/引用 No.7340-7 - 2018/10/23 (火) 03:42:04 - iPCR おおさん、これです！ agilent.com/cs/library/usermanuals/public/200523.pdf

(無題) 削除/引用 No.7340-6 - 2018/10/23 (火) 03:36:37 - おお >アジレントのホームページを見ると、一塩基置換で12サイクル。複数の塩基置換で16サイクル、複数のアミノ酸置換で18サイクルとありました。 あなたのプライマーのデザインなどわからないので答えようがないです。ミスマッチペアーが多くてやりにくいなら、Nestedで伸ばしていくてもあるかもしれません。 それとそのリンクを貼っていただけますか？

(無題) 削除/引用 No.7340-5 - 2018/10/23 (火) 02:35:02 - iPCR みなさん、回答ありがとうございます！ 実は5つのアミノ酸を変えることに2つの戦略を持っていまして、 一つはiPCR。もう一つはsite-directed mutagenesisです。 iPCRはうまくいかないなぁ...と思っていましたが、site-directed mutagenesisで3つの連続したアミノ酸の置換にまずはフォーカスして行ったところ、うまくいきました！ アジレントのホームページを見ると、一塩基置換で12サイクル。複数の塩基置換で16サイクル、複数のアミノ酸置換で18サイクルとありました。 この複数のアミノ酸置換は5つでも十分対応可能ということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7340-4 - 2018/10/22 (月) 23:28:11 - おお 非常にテクニックがいる方法ではありませんよ。 どんなPCRでもそうですが、PCRがよくかかるかはプライマーとターゲットの配列に依存しますので、そこをどのようにやりくりするかでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7340-3 - 2018/10/22 (月) 18:57:39 - AP プラスミドをinverse PCRして形質転換、環状化するときは、 PCRの段階では目的の産物が見えない程度でも十分。 むしろ、クローニング、精製済みのプラスミドを鋳型に30サイクルもかけるのは異常と言えるでしょう。副産物も生じやすいし、だいいち、こういう目的では配列のエラーが生じるのが怖いので、なるべくサイクル数は少なくするものです。5回とか10回とか。もちろんそれだけ回しても本来のサイズの産物が見えてこないというのは問題がありますけど。 あとinverse PCRの末端にオーバーラップを作って、ライゲーションなしに大腸菌内の修復系かなにかで環状化する方法もありますね。

(無題) 削除/引用 No.7340-2 - 2018/10/22 (月) 18:17:44 - sii >iPCRさん ＞5アミノ酸分を一度に変えることはさすがに不可能でした 連続する5アミノ酸ですか？連続する５アミノ酸くらいならsite-direct mutationで変異を入れるのは容易だと思いますが。。 あと、iPCRってinverse PCRでよかったですか？

iPCRでdeletion (pcDNA3.1+) 削除/引用 No.7340-1 - 2018/10/22 (月) 13:42:45 - iPCR いつも勉強させてもらっています！ 今、pcDNA3.1+にクローニングされた遺伝子の5アミノ酸分をアラニンに置き換えたいです。 site-directed mutagenesisで5アミノ酸分を一度に変えることはさすがに不可能でした（ですよね？）ので、iPCR法を用いようと思いますが、一度、Phusion polymeraseで30サイクル回したら、たくさんバンドが出てしまい（2kbがメイン）、目的の9.5 kbは全く増幅されませんでした。 iPCRは難しいのでしょうか？ もしiPCRがうまくいけば、9.5 kbのバンドを切り出し、PNKでリン酸化、ライゲーション、Dpn1処理で形質転換しようと思っています。 アドバイスいただけると幸いです。

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