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ありがとうございました。 削除/引用 No.733-9 - 2012/07/20 (金) 16:15:26 - na 皆様、ご意見ありがとうございました。 ご報告が遅くなりすみません。 今回の実験はある遺伝子をTOPOクローニング用に5'CACCリンカー付きプライマーでPCRし、増幅産物を複数のホスト系で発現させるために複数のTOPOベクターにクローニングしようとしていました。 同じPCR産物を使って他のTOPOベクターへのクローニングは上手くいったのでPCR産物に問題はないと思われました。 コロニーPCRは最初はベクターとインサートのプライマーペアを使っていましたが、その後ベクターペアのプライマー（インサート全長サイズが増える）でも行い、増幅が見られる物をミニプレップしていました。 が、今見直すと、コロニーPCRの増幅バンドは当たりだったものより薄いですので擬陽性であったと考えています。 （上手くいかなかったプラスミドの配列を確認したところTOPO配列のCACCがなく、由来不明の数十bpが入ってしまっているものばかりでした。） 現在はTOPOクローニングはやめ、制限酵素ライゲーションでのクローニングを試してみることにしました。 今後コロニーPCRをする場合はバンドがはっきりしているもののみを候補とすることにします。良い教訓になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.733-8 - 2012/07/19 (木) 01:51:54 - ab 私も擬陽性だと思います。 Ligation反応では、2つの切断面の片方がつながった直鎖状のものと両方つながった閉環状のものができると思うのですが、インサートとベクター側片方ずつを認識するプライマーでは直鎖状のプラスミドも増幅しますよね。これが擬陽性の原因だと思います。 コロニーPCRをするときはベクター側を認識するプライマー対を使っています。セルフライゲーションと大きさの違いで区別できるし、今のところ擬陽性が出たことはないです。同じプラスミドを用いる限り、同じプライマーを使えるので設計する手間もないです。 ただ、向きがわからなかったり、長いインサートだとPCRがしずらいので、結局ミニプレップして制限酵素で切断、シークエンシングして最終的には確認してます。

(無題) 削除/引用 No.733-7 - 2012/07/18 (水) 21:36:43 - Harmonia そろそろNo.733-3 とかNo.733-5 の疑問に答えるデータが出ていると思いますが。 宿主大腸菌と培養温度はどうですか？ 宿主によっては、世間一般の通念的な37℃でなく、低い温度での培養を推奨しているものもあります。配列が特殊な場合に限ると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.733-6 - 2012/07/18 (水) 20:23:21 - SS これは珍しいことなのでしょうか？ というくらい自分はよく経験しています。 ベクターを作成する際にコロニーPCRでインサートを確認していますが、 インサートと同じサイズのシングルバンドが泳動で出たので、 いざミニプレップして制限酵素で切断するとインサートが確認できないということが過去何度もありました。 インサートと同じサイズのバンドが出ることは皆様が論じていらっしゃるようにインサートPCR産物のコンタミネーションかもしれませんが、 経験上感じていることはちゃんとインサートが入ったコロニーはPCRで得られたバンドが他のコロニーより濃い印象があります。 コンタミとして入ったインサートよりプラスミドに組み込まれたインサートの方がテンプレートとしての量が多いからでしょうか？ 明確な根拠は示すことができませんが、PCRのバンドがしっかり出ているものを優先してミニプレップ⇒制限酵素切断でインサートの確認という手順をよくやっていて、今のところうまくいっています。

(無題) 削除/引用 No.733-5 - 2012/07/17 (火) 18:55:57 - ンンノ ちょっと変なことが起きてるみたいですね。 インサートもPCR産物ですよね。 たまたま片方のプライマーだけで増えてしまったDNA産物をクローニングしようと してませんか。 その片方のプライマーを使ってコロニーPCRをしたので擬陽性が出てしまってるとか。 クローニングしようとしてるPCR産物が本当に狙ってるものがちゃんと増えてるか どうかの確認はできませんか？制限酵素消化とかで。

(無題) 削除/引用 No.733-4 - 2012/07/12 (木) 11:16:16 - う 774さんに一票。 ライゲーション溶液をヒートショックで導入して その後、大腸菌液をプレートにまき、 生えてきたコロニーをピックアップしてPCRしてませんか？ ライゲーションに用いたDNAは、思っている以上に存在するときもあり、 プレートのコロニーが生えていないところを こすってPCRしても検出できることがあります。

(無題) 削除/引用 No.733-3 - 2012/07/10 (火) 09:34:02 - ~ ・コロニーが偽陽性だった ・プラスミドが濃すぎてPCRがうまくいかなかった PCRで、当たりのバンドが出ていないだけで、精製プラスミドが何なのかは確認していないのですよね。 まずは、精製プラスミドがどのような状態なのかを確認してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.733-2 - 2012/07/09 (月) 17:25:07 - 774 コロニーPCRが擬陽性だったという可能性はないでしょうか？ Ligationに使ったインサートがそのまま増幅されてしまった等で。

液体培養でインサート欠落？ 削除/引用 No.733-1 - 2012/07/09 (月) 16:41:42 - na 某メーカーのTOPOクローニングベクターの遺伝子クローニングについてです。 形質転換後のコロニーPCRでは当たりサイズの遺伝子断片が増幅されるのですが（プライマーはベクター側とインサート内の特異的プライマー）、その後、当たりコロニーを液体培養して抽出したプラスミドを鋳型に同じPCRをかけると何も増幅されなくなります。（プラスミドは取れていました） このような現象を経験されたことのある方、いらっしゃいましたらアドバイスいただけたらと思います。 宜しくお願いします。

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