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(無題) 削除/引用 No.7309-10 - 2018/10/17 (水) 16:13:24 - qq ＞バックグラウンドの値を適切に取り除く 「適切」はいろんな意味で難しいのです。 細胞一つがROIだということでよければ、 引き算以前の問題として、バックグラウンドに比べてシグナルが十分に大きければ何の問題もないわけですから、、 １）GFPよりもS/N比の高い蛍光色素や波長を使う。 ２）変動しないコントロールを一緒に用意する。例えば、常在性の核タンパク質-RFPを一緒にトランスフェクトして、GFP/RFPのような表示を用いる。退色に強いDNA染色があれば、それもよいと思う。 ImageJでバックグラウンド補正するとして、穏当な方法から挙げるとすると、 １）引き算はしないで、時系列のフレームから、最低値を推定する。 ２）各フレームのROIの最低値を引き算する。 ３）各フレームのROIをProcess>subtract background（radiusの指定をROIよりやや大きめにする）で補正してしまう。 などが考えられるかもしれませんが、それぞれのケースで選択肢が異なるでしょうから、なんとも言えないですね。

(無題) 削除/引用 No.7309-9 - 2018/10/17 (水) 10:57:58 - よもぎ >注意するところがあるとすれば、バックグラウンドの値を適切に取り除く必要がある点です。 よろしければ、この点について詳しく教えていただけないでしょうか？ バックグラウンド(細胞がないところ)を同様に測定して値を減算するのかそれとも、画像処理か何かでバックを一定にして測定するのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7309-8 - 2018/10/16 (火) 22:37:42 - qq それが良いと思います。 Integrated densityはIntensityとは別で、領域のIntensity（density）の総和（もしくは積分値）であり、mean x areaと同じ値になります。 注意するところがあるとすれば、バックグラウンドの値を適切に取り除く必要がある点です。

(無題) 削除/引用 No.7309-7 - 2018/10/16 (火) 11:31:27 - よもぎ ご意見ありがとうございます。 海外のサイトや論文を見てみると一番初めにおっしゃられたようなIntegrated Density(intensity?)をimageJで測定している方が多いように感じられました。 まずはこれでやって見て考えて見ます。

(無題) 削除/引用 No.7309-6 - 2018/10/16 (火) 05:51:38 - おお >> 分散が広がるというのは検定方法もあり違う分野ではやったりすることがあるようです。 >よろしければURLなどありましたら、お願いいたします。 学生が論文など読みながら方法論を議論しているときの一つのやり方として出てきたもので、私自身はソースを持っていません。 RNaseqなどで発現プロファイルを比較するとき、たとえば病気と正常の比較で病気に関するシグナルカスケードが変になっていることが原因とすると、ヘテロな集団（変異が特定遺伝子に必ずしも見つかるわけではないけど、フェのタイプは一致するなど）において、ある遺伝子の上流から異常が始まっているか、下流から異常が始まっているかでなどでその遺伝子の発現の動向が変わる可能性があるわけで、方法論としては価値があるなと思った次第です。

(無題) 削除/引用 No.7309-5 - 2018/10/14 (日) 17:29:06 - よもぎ > 原因は何でしょうか？そこがわかれば明らかに逸脱している要因を根拠にそのフレームはデーターに入れないという主張もしやすくなるかと。 > また顕微鏡やそのシステムの不具合の可能性もかんがえてメーカーに問い合わせてみるのもいいかもしれません。 原因がわかれば一番良いのですが、現象が起こるタイミングもバラバラで、見当がつかなくて... 強いて挙げるとしたら、水銀ランプの劣化が原因なんでしょうか？そこらへんのことをメーカーに尋ねてみたいと思います。 > 分散が広がるというのは検定方法もあり違う分野ではやったりすることがあるようです。 よろしければURLなどありましたら、お願いいたします。 > ただし腑に落ちないのは、たとえば異常がない場合１００の強度でばらつきが１０％のときと１０のときのばらつきが１０％のときでは、前者に比べて十分の１になってしまうので、最大蛍光強度が下がるとばらつきもヘリ、おっしゃっているようにうまくいくのがピント来ません。 最大輝度では外れ値に当てはまるような明るすぎるものと暗すぎるものは排除して、各細胞の平均を取って描いており、標準偏差では排除された細胞は除いた細胞から測定して平均しているいるからだと思います。 > 最大蛍光強度をとるのはわからなくないですが、核のシグナルが強くなるというには直接的でないのでもう少し直接的な図り方がないのかなぁとおもいます。たとえば細胞質に非常に小さい蛍光強度のエリアができてた場合そこの蛍光強度をとってしまうわけですから、そうするとそれを否定するためにひとフレームづつ、その最大蛍光強度がどこのスポットなのか調べてからデーターにしなければならなくなり、もし核外のスポットを認識しているものがいくらか混じっているとデーターとして使えないということになります。 確かにその部分は私も疑問に思っていました。これまでは明らかに大きすぎるような値が出た細胞を注視して囲み直していたりしていましたが、そこまで異常ではないものに関しては見ていなかったので、別途そのようなデータも必要になりますね。 ありがとうございます。参考になります。

(無題) 削除/引用 No.7309-4 - 2018/10/14 (日) 08:59:57 - おお >撮影中たまに画面の明るさが褪色が急激に進んだかのように暗くなることがあり、グラフが書けなくなることがあります。 原因は何でしょうか？そこがわかれば明らかに逸脱している要因を根拠にそのフレームはデーターに入れないという主張もしやすくなるかと。 また顕微鏡やそのシステムの不具合の可能性もかんがえてメーカーに問い合わせてみるのもいいかもしれません。 >そのため、周りの明るさにあまり影響されにくい標準偏差を測定して選択領域の輝度のばらつきを測れば良いのではないかと考えました。 分散が広がるというのは検定方法もあり違う分野ではやったりすることがあるようです。 ただし腑に落ちないのは、たとえば異常がない場合１００の強度でばらつきが１０％のときと１０のときのばらつきが１０％のときでは、前者に比べて十分の１になってしまうので、最大蛍光強度が下がるとばらつきもヘリ、おっしゃっているようにうまくいくのがピント来ません。 最大蛍光強度をとるのはわからなくないですが、核のシグナルが強くなるというには直接的でないのでもう少し直接的な図り方がないのかなぁとおもいます。たとえば細胞質に非常に小さい蛍光強度のエリアができてた場合そこの蛍光強度をとってしまうわけですから、そうするとそれを否定するためにひとフレームづつ、その最大蛍光強度がどこのスポットなのか調べてからデーターにしなければならなくなり、もし核外のスポットを認識しているものがいくらか混じっているとデーターとして使えないということになります。だからやめろというわけではなく、確かに核を図っているという方法論的なものをちゃんと示せるのなら、私のコメントはあまり意味がありませんから、そのままでいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7309-3 - 2018/10/12 (金) 13:41:27 - よもぎ ご返信ありがとうございます。正直計算に疎いもので、よく理解できていませんが、調べて考えてみます。 > ところで、最初、最大輝度をグラフにして評価しているのはどういうことなのでしょう？ 普段は細胞質に局在しており、その後核内へ局在するので、GFPのシグナルの強さが一点に集まって明るくなるのでタイムラプス撮影で核時間ごとに最大輝度を測って評価しています。細胞全体を領域指定しています。 あまり答えになっていないと思いますが、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.7309-2 - 2018/10/11 (木) 22:12:31 - qq 蛍光観察で分解まで輝度で定量していない者ですが、 領域（核か？細胞か？）の蛍光強度ｘ面積（Int-Dens）が大きくなったり小さくなったりすれば、領域に集積したとか、領域から消失したと考えるのでしょう。 このとき、領域（核か？）の蛍光強度ｘ面積が変化しないで、蛍光強度の標準偏差が大きくなったり小さくなったりすれば、punctaになったとか、diffuseになったとか考えるということかなぁ。 Int-DensとStdevの両方が変化する可能性もあるだろうから、その辺りを予め考えておく必要があるような気がします。 何だったら、Int-DensとStdevを散布図にして、それぞれの細胞や、時系列の細胞をプロットしてみると良いのかもしれません。 ところで、最初、最大輝度をグラフにして評価しているのはどういうことなのでしょう？

蛍光画像解析における標準偏差測定について 削除/引用 No.7309-1 - 2018/10/11 (木) 15:48:26 - よもぎ 私は現在、核に局在するタンパクにGFPtagを融合して局在から分解までライブセルイメージングを行っている学生です。 今までは撮影した生の画像の細胞部分を選択して、最大輝度を測ってグラフを書いていたのですが、撮影中たまに画面の明るさが褪色が急激に進んだかのように暗くなることがあり、グラフが書けなくなることがあります。 そのため、周りの明るさにあまり影響されにくい標準偏差を測定して選択領域の輝度のばらつきを測れば良いのではないかと考えました。 実際に行なった結果、描けたのですが、文献などを探してみても標準偏差で蛍光画像の測定を行なっている方が見当たらず、処理方法がこれでも良いのか自信がありません。 どなたか蛍光観察で分解まで輝度で定量している方がいらっしゃいましたら、この測定方法についての意見やその他の測定方法など教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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