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(無題) 削除/引用 No.7307-11 - 2018/10/14 (日) 07:25:56 - mon 結合させてからのPFA固定ですかね？ CHO細胞を使ってある程度の条件検討はできるでしょう、

(無題) 削除/引用 No.7307-10 - 2018/10/13 (土) 17:35:24 - AP フォルムアルデヒド固定そのものが抗原性を失わせるのであれば、PLPも固定剤はフォルムアルデヒドなので期待薄ですね。 ただ本当にアルデヒドが悪者なのかは、まだわかりませんよ。 先に触れたように、界面活性剤のせいの可能性もあると思いますけれど、それについてはどうですか。

(無題) 削除/引用 No.7307-9 - 2018/10/13 (土) 15:49:01 - おお いちど徐々にPFA濃度を下げて様子見てもいいかもしれない。そのリコンビナントを結合させてからWash後再固定もできるだろうし。

(無題) 削除/引用 No.7307-8 - 2018/10/13 (土) 15:32:24 - AP 生CHOで再現よく細胞膜が染まったと書いているところを見ると、標的のリガンドは膜タンパク質なのですね（あるいは糖鎖ほか？）？　拡散性の分子ではなく。 往々にして、膜タンパク質は疎水性溶媒や界面活性剤を嫌います。足場になる脂質膜の溶出によって抜けてしまうからです。アセトン、アルコールなどの脱水固定は向かないかもしれません。PFA固定のあとの操作でTriton X-100やTween 20などを使っている場合は、省くか濃度を下げるか、もっと弱い界面活性剤（ジギトニン、サポニンなど）を使うといいかもしれません。 膜タンパク質をよく固定するのはPLP。これは糖鎖を過ヨウ素酸で開裂してアルデヒド基をだすことで架橋がかかるようにしたものです。糖鎖をエピトープとする抗体には向きません。 Formaldehyde自体もアミノリン脂質などを標的に膜をよく固定すると言われていますが、Mg++やCa++を加えるとさらに効果的に固定されます（4% PFA in PEM bufferなど）。

(無題) 削除/引用 No.7307-7 - 2018/10/13 (土) 05:25:42 - おお 海馬のスライスを培養するとか言う方法もあるから、組織を生でスライスして生理的な条件下でそのリコンビナントに晒して洗ってから凍結切片作成するなり、固定するとかできればいいんだけどね。

(無題) 削除/引用 No.7307-6 - 2018/10/12 (金) 00:03:07 - fcgvbhjんkml 小さい事ですが、検出は標識したprotein-Aを使用するのですか？それとも当該蛋白質に対する特異抗体で一般的な免疫組織染色でやるのですか。

(無題) 削除/引用 No.7307-5 - 2018/10/11 (木) 18:52:50 - Q 似たような実験の経験がありますが、私もPFAで固定した切片はどうやっても無理でした。結局、新鮮凍結切片を作製してアセトンで固定したらうまく染まるようになりました。反応は当然4℃で。脳と筋肉はこれで出来ました。

(無題) 削除/引用 No.7307-4 - 2018/10/11 (木) 18:15:27 - fcgvbhjんkml 凍結組織切片で、抗原や抗体によってはPFAだと上手く行かないことがたまにあり、そういうときは冷アセトンなどの有機溶媒固定は普通にやってます。市販の抗体の中には、そのように指示しているものもあります。抗原性を損なわない利点はありますが、欠点として、柔らかい組織だと、PFA固定と比べて（脱水で組織が縮むため）、外見が今一になることもあり、細胞内局在など微細な構造の観察には適さないかもしれません。抗原によっては固定中に流出することもあるらしいです。また（培養細胞のはなしですが）細胞骨格系の分子の免疫染色は有機溶媒固定だと上手く行かないと聞いた事があります。

(無題) 削除/引用 No.7307-3 - 2018/10/11 (木) 15:24:23 - mon おおさんが紹介したPLP法も記載されています。 http://www.kbkb.jp/bus/fixed.html どれが良いかは分かりません。試行錯誤だと思います。

(無題) 削除/引用 No.7307-2 - 2018/10/11 (木) 11:47:40 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12597622 この方法は糖蛋白など膜のタンパク質に対していい結果が出ることが多いと聞きますが、どうでしょうか。

組換えタンパク質で組織染色を行う時の固定方法 削除/引用 No.7307-1 - 2018/10/11 (木) 10:39:02 - こやま いつも勉強させてもらっています。 私の実験で、human IgG Fc potionが融合された組換えタンパク質をR＆Dから購入しました。 これを使ってフローサイトメトリーや、プルダウンアッセイを行い、既知のリガンドと結合することを確認することができました。 最後にビボで、マウス組織をこの組換えタンパク質でどうにか染めたいのですが、固定により抗原エピトープが変わってしまうかもしれないと考え、まず4％PFAで固定したCHO細胞を染めたところ、やはりシグナルが消失しました。一方、身固定のものは再現よく細胞膜が綺麗に染まっていました（この場合は4度で染色しました）。 以上より、おそらく4％PFAやホルマリン固定の組織切片は染まらないだろうと考えています。 そこでホルマリン以外の方法で組織を固定するような試薬はありませんでしょうか？ もちろん未固定での凍結切片は試すつもりですが、できれば固定したいです。 例えば、細胞染色で行うようなメタノールやアセトン固定なんかを組織に適用することは可能でしょうか？ よろしくお願いいたします。

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