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(無題) 削除/引用 No.7300-5 - 2018/10/10 (水) 18:45:44 - NMI ありがとうございました！ まずは二次抗体のみで染色してみます。

(無題) 削除/引用 No.7300-4 - 2018/10/09 (火) 18:29:41 - AP 二次抗体の交差性をよくよく検討して見る必要があります。 他のかたも指摘されているように、二次抗体だけで反応・検出してみるのが手っ取り早い。 そんなの面倒と言うなら、二次抗体もサブクラス特異的なモノクロにしたらいいかもしれない。 二次抗体のポリクロなんてのは、標的動物のIgで免疫はしても、できる抗体は他の動物のIg（やその他のタンパク質）にも反応するものが多くできてくる。当然だよね。 これを除去し、他種に交差反応しないようにするためにやっているのは、主な他種動物のIgで吸収するという、非常に古典的で素朴な方法です。 製品によって性能が違うのも、交差が完全に排除された抗体がないのも、当たり前に思えるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7300-3 - 2018/10/09 (火) 15:07:32 - み 単核球といっても色々あるけど、 Fc受容体とか発現している細胞なら2次抗体をトラップするんじゃない？ 2次抗体のみではシグナルが出ないことを確認されているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7300-2 - 2018/10/09 (火) 13:51:18 - mon (1)二次抗体の特異性は？具体的には、ラットIgGに結合しないことを保証された抗体でしょうか？ 二次抗体は、各種IgGで吸収済みの特異性が高いものが販売されています。ただalexaで標識されているものは特異性が高そうな...。 (2)自家蛍光はありませんか(二次抗体がなくても光る）? (3)感度設定は同程度でしょうか？自動だと強引に明るく撮影する場合があります。 (4)古い標識抗体は、希に微少な蛍光の粒(沈殿？）が混ざるときがあります。遠心して上清を使うと、このようなゴミのトラブルを避けることができます。 (5)単に抗体濃度が高すぎて、非特異的結合を見ている場合もあります。

細胞染色でのトラブル 削除/引用 No.7300-1 - 2018/10/09 (火) 13:38:07 - NMI 免疫染色初心者です。ラットの単核球の細胞染色を行ったのですが、 一次抗体を、マウスのmonoclonalIgGで反応させて 二次抗体を、一つはdonkey anti マウスIgG alexa 594 もう一つは、Goat anti マウス IgG alexa 488で反応させました。 両者とも単染色です。 蛍光の色が違うだけなので、染色パターンは同じで、色が緑か赤かにかわるだけかと、思っていたのですが、 実際にレーザー顕微鏡をのぞくと、赤で染色したものと緑で染色したものは全く違うパターンとなっていました。 一次抗体は同じですので、染色パターンは同じになるはずなのですが、かなりの違いがでてしまっていて困っています。 初心者の質問で恐縮ですがなにか考えられる原因はありますでしょうか

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