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(無題) 削除/引用 No.7289-10 - 2018/10/05 (金) 22:17:30 - abc >AP様 情報ありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.7289-9 - 2018/10/05 (金) 21:10:11 - AP 固定標本でやるなら、膜と膜タンパク質とをよく固定し抗原性の保持に優れたPLP固定液を試してはいかが

(無題) 削除/引用 No.7289-8 - 2018/10/05 (金) 20:23:44 - abc >774R様 アドバイスありがとうございます！やってみます。

パッチング 削除/引用 No.7289-7 - 2018/10/05 (金) 16:54:20 - 774R 生きたまま2次抗体まで反応させると、抗体が2価であるため、2次抗体が1次抗体を凝集してしまい、元の局在と変わってしまう可能性があります。（パッチング） 出来れば1次抗体を反応させた後でPFA固定をして、その後にブロッキング→2次抗体の順でやったほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.7289-6 - 2018/10/05 (金) 06:24:42 - abc >Mac様 教えていただいたやり方でやってみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7289-5 - 2018/10/05 (金) 06:21:53 - Mac 私の場合、４oCで長時間抗体反応すると剥がれてくる付着細胞だったので、一次抗体、二次抗体とも３０分でやってました。 浮遊細胞であれば、フローサイトの場合と同様に氷上で染色した後、サイトスピンでスライドに貼り付ければ良いと思いますが、この場合も染色時間は30-60分で十分と思います。

(無題) 削除/引用 No.7289-4 - 2018/10/05 (金) 06:00:24 - abc >おお様、Mac様 早速、アドバイスを投稿していただきありがとうございます。 なるほど、生細胞のまま抗体染色して、その後、PFAで固定すれば良いということですね。 PFA自体が、細胞膜を壊すことがあることは知りませんでした。 抗体の染色時間はどのくらいでしょうか？抗体にもよると思いますが、今まで私は、一次抗体は４度でover night、二次抗体は室温で二時間で処理していました。 abcamのホームページにあるprotocol（https://www.abcam.com/protocols/indirect-flow-cytometry-protocol）では少なくとも、４度で30min以上となっていますが、どのくらいが適当でしょうか？ ご経験があれば、教えていただけたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.7289-3 - 2018/10/05 (金) 05:34:27 - Mac フローサイトメトリーの細胞表面染色と同じ事をすれば良いです。生きている細胞のまま、低温でエンドサイトーシスを抑制した条件下で抗体染色してから、固定すれば良いです。PFAで固定してしまうと、透過処理しなくても細胞内が結構染まって困った経験が、私もあります。

(無題) 削除/引用 No.7289-2 - 2018/10/05 (金) 03:54:26 - おお PFAで固定すれば膜もかなり傷むでしょう。実際細胞内のものも界面活性剤抜きで染まることはよくあります。 固定せずにPBS溶液中で抗体にさらして洗浄後に固定するという手もあります。それでも抗体が認識した蛋白についたままエンドサイトーシスで取り込まれてしまい、一部のエンドソームが染まることもあるかもしれません。

細胞膜を壊さない免疫染色法 削除/引用 No.7289-1 - 2018/10/05 (金) 01:09:09 - abc 私は現在、ある膜受容体の研究をしており、免疫染色で細胞膜上にある受容体だけを検出できないかと思い実験しています。 細胞を4% PFA in PBSで固定した後、膜透過処理なしで、2% BSA in PBSでblockingし、一次抗体、二次抗体で染色しています。 bufferなどには、tween20のような界面活性剤は入っていないにも関わらず、confocal microscopeで見てみると細胞内のERやvesicleなどが染色されてしまいます。 なぜ、細胞膜が染色の過程で壊れてしまうのか見当がつかず、困っています。 何かアドバイスをいただけたら幸いです。

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