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MC3T3-E1のトリプシン処理時間について トピック削除
No.7284-TOPIC - 2018/10/03 (水) 17:34:08 - 初心者
細胞実験初心者です。
今、75cm2フラスコを使ってMC3T3-E1の培養・継代を行っています。

継代手順としてPBSでリンス後のフラスコに0.05%trypsin/EDTAを5ml → インキュベータ 3min → 10%FBSの培地5ml加える→ ピペッティング と教わったのですが、この方法だと細胞が剥がれずフラスコ底面に残ってしまっています…

実験で細胞を使うためできるだけ多く回収したいのですが、単純にトリプシン処理時間を延ばしていいものなのか分からず…

実際にMC3T3-E1を培養したことのある方にお聞きしたいのですが、どのくらいトリプシン処理に時間をかけていたのか教えて頂きたいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.7284-6 - 2018/10/06 (土) 18:35:42 - 初心者

おお様、mon様、トリプシン様、ablation様
みなさまご回答ありがとうございます。

今後、皆様のアドバイスを参考に培養・継代を行ってみたいと思います！
またいろいろお聞きすることがあるかもしれませんが、その時はよろしくお願いいたします。

本当にありがとうございました。

MC3T3-E1のトリプシン処理 削除/引用
No.7284-5 - 2018/10/04 (木) 18:27:38 - ablation
MC3T3細胞ではありませんが、接着性細胞RAW細胞を扱っています。

私は細胞は10pディッシュで培養し、PBSでリンス後、トリプシンを入れて3分間37℃でインキュベートして、まずそのまま1000µｌピペットでピペッティングして、7〜8割くらい細胞をはがします。それから培地を入れてさらにピペッティングして細胞浮遊液にします。トリプシン濃度は0.05％です。

理研バイオリソースセンターの細胞材料室のHPにはがしにくくなったRAW細胞に関する注意事項が載っています。はがそうとあまり長く細胞をトリプシン処理するのは良くないようです。

接着性の細胞は剥離の条件によって、よけい剥がしにくくなるようです。
ご参考にして下さい。

(無題) 削除/引用
No.7284-4 - 2018/10/04 (木) 14:45:21 - トリプシン
培養実験初心者とのことなので、
先輩に実際の作業を見てもらうのが一番早いかもしれません。

先輩は3minで剥がれててあなただけ剥がれていないのであれば
ピペッティングのやり方、またはおおさんの言うようにフラスコを叩くなど
手技の問題もあることでしょう。
本当に剥がれにくい細胞であれば、プロトコールがトリプシン3minとは
ならないんじゃないかなと思います。


あとは一度剥がれていてそれでも残るのであれば
フラスコから回収した後にもう一度培地を加えてリンスし回収すれば
底面に残った細胞もかなり回収出来るかと思います。

ともあれ解決の近道は実際に見てもらうことかなと思います。

(無題) 削除/引用
No.7284-3 - 2018/10/03 (水) 20:15:52 - mon
接着が強い細胞の場合、というか普段から0.02%(w/v)EDTA入りPBSでリンスしています。
フラスコ内の培地を吸い取ったあと、30秒ほど（乾燥しない程度に）フラスコを立てておくと、結構な量の培地が底に溜まりませんか？それを再度吸い取るだけでもトリプシンの効果は強くなりますよ。

(無題) 削除/引用
No.7284-2 - 2018/10/03 (水) 17:59:03 - おお
一般論ですが、、、

顕微鏡で観察しながらはがれそうになるタイミングで培地を加えるといいです。正確に何分にするというのはあまりしっかりした基準にはならないです。なかなかはがれないならたぶんPBSでの洗いで十分培地の血清成分などが除けてないのかもしれません。培地を捨てるとき取れるだけとるようにして、PBSも大目にしてよく振って洗うといいかもしれません。

トリプシン処理後培地を加える前にフラスコを横に振りながらたたいたりして細胞を浮かせてしまうと、外れかけの細胞が培地を入れることでまた張り付いたりするのが防げるかもしれません（再度張り付くって言うことが起こっているかというのはよく分かりませんけど）。

MC3T3-E1のトリプシン処理時間について 削除/引用
No.7284-1 - 2018/10/03 (水) 17:34:08 - 初心者
細胞実験初心者です。
今、75cm2フラスコを使ってMC3T3-E1の培養・継代を行っています。

継代手順としてPBSでリンス後のフラスコに0.05%trypsin/EDTAを5ml → インキュベータ 3min → 10%FBSの培地5ml加える→ ピペッティング と教わったのですが、この方法だと細胞が剥がれずフラスコ底面に残ってしまっています…

実験で細胞を使うためできるだけ多く回収したいのですが、単純にトリプシン処理時間を延ばしていいものなのか分からず…

実際にMC3T3-E1を培養したことのある方にお聞きしたいのですが、どのくらいトリプシン処理に時間をかけていたのか教えて頂きたいです。
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