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(無題) 削除/引用 No.7274-8 - 2018/10/05 (金) 17:24:10 - MTP よくあるのは、凍結融解後に混和が足りないというミスですね。 その場合は、ピペッティングもしくはvortexに一瞬でもかければ改善されます。

(無題) 削除/引用 No.7274-7 - 2018/09/30 (日) 10:25:59 - おお 何マイクログラムのRNAを何マイクロリッターのRT反応溶液でcDNAを作ってますか？

(無題) 削除/引用 No.7274-6 - 2018/09/29 (土) 23:53:52 - ふみ よくあるのは吸着での実効濃度低下だと思います。 cDNA希釈用バッファを使う、RNA投入量を多くする、とよいかもしれません。 それで解決しなければ、RNA精製過程にPhOH処理を2回ほど加えるとか、どうでしょうか？ 奏功しない気が多分にしますが、逆転写後の液を薄いEDTA溶液で数倍に薄めるとか。 あと、かからなくなる内部標準は、1つでしょうか。別の遺伝子は？ 水は、実験室内の精製装置由来？もしそうなら、キットに添付のものを試してみるとか。 ひょっとしてですが、チップとチューブはオートクレーブしない方が吉かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7274-5 - 2018/09/29 (土) 18:24:10 - M 皆様　早速の返信ありがとうございます。 mom様　チューブはDNA低吸着の物とチップはフィルターチップの新品を使っているので、問題はRNAでしょうか？一度保存を−80℃で行って比較してみます。アドバイスありがとうございます。 おお様　一回目のPCRが終わった後は、−20℃の冷蔵庫で保存しています。一日の内に同じサンプルを２回かけたことはないのですが、2日後にかけてPCRがかからなかったことはあります。 AP様　吸着の可能も考えて、DNA低吸着チューブに替えましたが同様の現象が起きてしまいました。ただ、ご指摘して頂いた通り吸着の可能性もあると考えています。一度希釈なしで保存と提案して頂いた希釈溶液を試してみようと思います。アドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7274-4 - 2018/09/29 (土) 17:36:24 - AP 過去トピにもあったけれど、保存中の吸着ロスには注意したほうがいい。 チューブの品質により程度の差はあれど、完璧に安全という製品はないだろう。特に低濃度で保存しているときは吸着ロスの影響が大きい。例えば高濃度だと5%のロスにたいして低濃度だと90%とか。 定量PCRなどにつかうテンプレートの希釈用溶液なんかも市販されているが、BSA, 界面活性剤、yeast tRNA、linear polyacryaideなどを混ぜて自作するも良し。吸着の影響で段階希釈の検量線が直線にならなくなるのを防ぐためのものだが、保存サンプルの吸着を防ぐのにも使えるだろう。わたしは希釈したプライマーの保存にも使っている。

(無題) 削除/引用 No.7274-3 - 2018/09/29 (土) 15:47:20 - おお 一回目がおわったあとサンプルはどのように保存したのですか？ その日のうちに立て続けに２回やっても２回目はだめですか？

(無題) 削除/引用 No.7274-2 - 2018/09/29 (土) 15:42:59 - mon 単純に考えると、チューブかチップかRNAに原因がある。 cDNAを-80℃に保存して比較してみてはいかがでしょうか。

cDNAの分解について 削除/引用 No.7274-1 - 2018/09/29 (土) 15:23:18 - M 実験を始めたばかりで勉強不足なところもあると思いますが、よろしくお願いします。 cDNAを合成してリアルタイムPCRをかけているのですが、cDNA合成直後は20サイクル程で立ち上がりが見られるのですが、次にかけると40サイクルぎりぎりもしくは、検出されなくなります（遺伝子は、内部標準を使っています。）。DNaseのコンタミを疑って、DNaseなしのcDNA合成キット(iScript™ cDNA Synthesis Kit)を用いましたが、同様の現象が見られました。 その後、水、プライマー、KOD、DNA-low binding tube、サンプル等を新品に替えましたが改善しませんでした。 また、同じRNAサンプルから新しく逆転写するとPCRがかかりますが、二回目以降は上記のような現象が見られます。 cDNAの保存は-20℃です。 サンプルは、魚のホールサンプルから抽出しています。 実験の流れは以下の通りです TRI ReagentでRNA抽出 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA RemoverでcDNA合成 リアルタイムPCR (KOD SYBR) です。 お手上げ状態で、どうしたらよいかわかりません。 なにかアドバイスを頂ければ幸いです。 よろしくお願いします。

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