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(無題) 削除/引用 No.7257-12 - 2018/09/29 (土) 19:01:23 - ななしん 関係ないかもしれませんが、in fusionに使うベクターを制限酵素で調製する場合はベクターの品質も要求されると思います。 経験的に、フレッシュなものを使うと効率が良いです。 たぶん、プラスミドにnickが入っていると、効率が落ちるのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.7257-11 - 2018/09/26 (水) 23:51:05 - n 詳しくありがとうございました！ 今日、オーバーラップPCRをかけて見た所、きれいに目的サイズのバンドが 増えていて、ちょっと感動しました。 Inverse PCR後のInfusionは、実は昨日からPCRをかけていまして 今日トラフォメしました。 infusionなしのinversePCRが、テンプレートサイズのためか（15kb-） 良い酵素を使っても軒並みワークしなかったので、まあ保険、、のような感じなのですが 明日にはコロニーが出てくるかと思うので、結果が出ると思います。

(無題) 削除/引用 No.7257-9 - 2018/09/26 (水) 09:21:38 - カートン箱 オーバーラップPCRについてですが、10~15bpの末端相同配列で十分つながります。方法も仰る通り、断片を等モルで混合して通常通りPCRするだけです。 プライマーはin fusion用のmutation断片二つを増やす一番外側のもので試して、ダメそうなら少し外側のプライマーを再設計すればよいかと。 　A　　　　　B −→　　　　←− ――――――−−　　　↓断片�A ↑断片�@　　　−−―−−−−−−− 　　　　　　　−→　　　　　　←− 　　　　　　　　C　　　　　　　D ↑で言えばのA,Dプライマー。 だめならA,Dの外側のプライマーE,F（例えば元々の野生型配列のサブクローニングに使ったもの。新規設計も有り）でmutant断片�@，�Aを増やし、A,DまたはE,FのプライマーセットでオーバーラップPCR と、ここまで書いてふと思ったのですが、 元プラスミドに対しB,Cでinverse PCR →増幅産物をself in fusion →欲しいmutant断片を制限酵素で切り出し →元のプラスミドの該当部分と入れ替え でも同じことができそうですね。 最初のinverse PCRでoriと選抜マーカーに変異が入らなければ、制限酵素処理に十分な量のプラスミドが取れると思います。

(無題) 削除/引用 No.7257-8 - 2018/09/25 (火) 19:50:27 - n ご意見ありがとうございます。参考になります。 > Infusionの設計はタカラバイオのオンラインツールで、 > 設計していますか？ はい。3断片連結なので、多少イレギュラーな使い方をしましたが、 制限酵素サイトのデザイン等はツールの通り使っており、見た所ミスはありませんでした。 > PCR-insert 5'側断片、3'側断片はDpnI処理していますか？ 処理しておりますが、トラフォメまではしていませんでした。 前回詳しく書いていなかったのですが、得られたコロニー数が〜12程度で 全てsequenceを読んでWTだったので、ハズレを拾っているというよりは mutantができていないのだと思われます。 > ユニークな制限酵素サイトで切り貼りできるのなら、例えば > 二種類のmutation断片を作った段階でこれをオーバーラップPCRで連結 そうですね。infusionのprimerを変えて、とも考えていたのですが、 おおさんのアドバイスと合わせて、地道に行った方が良さそう、、と心を切り替えることができました。。。 次の手として、insertに当たるfragmentを、TA cloningし、inverse PCR の手法でmutationを入れて、オリジナルのバックボーンに戻す手法に切り替えようかと 思っていたのですが、オーバーラップPCRでのPCR断片連結というものは初めて聞きました。 おそらくオーバーラップする２つのPCR産物を混ぜてテンプレートとし (人によっては混ぜてからprimerなしで加熱しアニーリングさせて)、 PCR増幅するという手法でしょうか。 検索でプロトコルが見当たらなかったのですが、オーバーラップ部位は15bp程度で大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7257-7 - 2018/09/25 (火) 13:02:00 - moz >Dpn1は使用しており、バックボーンのみコントロールは何も生えてこないのですが。 PCR-insertに鋳型plasmidが残留している可能性はないですか。 つまり、 PCR-insert 5'側断片、3'側断片はDpnI処理していますか？ また、それだけ加えたコントロールではコロニーは0ですか？

(無題) 削除/引用 No.7257-6 - 2018/09/25 (火) 10:24:17 - カートン箱 おおさんの意見に同意です ユニークな制限酵素サイトで切り貼りできるのなら、例えば 二種類のmutation断片を作った段階でこれをオーバーラップPCRで連結 →TAクローニング（場合により省略可） →制限酵素で断片切り出し →バックボーンへライゲーション という手法をとることもできます。 ステップ数が増えるので多少面倒ですが確実な手段だと思います。 また、長鎖に対しPCRを掛けるよりは、変なところに変異が入る危険性も低いのではないかと。 In fusionについて個人的には、断片数が増えるほどクローニングの効率が落ちる印象が強いです。 特に3断片以上は、断片の濃度、モル比、配列の相同性など、気を配らないとまともに3断片つながらなかった(2断片つながったものが出る等)ことがあります。

(無題) 削除/引用 No.7257-5 - 2018/09/25 (火) 09:50:34 - おお 1) mutation前後のユニーク制限酵素サイトで約1kbくらいを切り出し、バックボーンを生成。 これができるんだから、Mutationをいれたフラグメントも制限酵素できってLigationしてしまってもいいような気がする。

(無題) 削除/引用 No.7257-4 - 2018/09/25 (火) 08:18:11 - ぬ Infusionの設計はタカラバイオのオンラインツールで、 設計していますか？ プライマーが間違っている可能性あるかもしれません

Infusion使用のmutagenesis 削除/引用 No.7257-1 - 2018/09/25 (火) 00:42:45 - n 現在、ベクターにpoint mutationを導入しようとしています。 ベクターが15kb超えと大きいサイズで、inverse PCRでmutationを入れるメソッドだと 何も生えてこなかったので、InFusionを検討しているのですが、上手くいきません。 方法論に問題ありでしょうか？ mutation中心に1kbくらい切り出し、バックボーンと、mutation入りインサートを入れたPCR断片２つ をinfusionで連結するという考え方です。 図がないと説明が難しいのですが、 1) mutation前後のユニーク制限酵素サイトで約1kbくらいを切り出し、バックボーンを生成。 2) 元ベクターをテンプレートにしたPCRで、mutation中心にし、2つに分けてinsertを作ることで mutationを入れる。１つの断片は、5'側が、1)のバックボーン切り出し部位と15bp相同になるようにprimerを設計し、3'側プライマー真ん中あたりにmutationを入れる。もう一つは、5'側にが先のPCR断片の3側と15bp相同であるようにし（つまりmutation入り）、3'側はベクターバックボーンのもう片側の切り出しサイトと15bp相同にする。 これを、バックボーン、PCR-insert 5'側断片、3'側断片と連結できるかと思ったのですが コロニーが生えてくるものの、すべて元ベクターと同じ配列です。 Dpn1は使用しており、バックボーンのみコントロールは何も生えてこないのですが。 どのあたりに問題があるのか不明で、困っております。 もしアドバイスありましたらよろしくお願いいたします。

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