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(無題) 削除/引用 No.7241-12 - 2018/09/19 (水) 20:37:41 - そら おお様 ご返答ありがとうございます！ 論文読んでまた検討させていただきます！ 色々な方法があるのですね、不勉強でした。

(無題) 削除/引用 No.7241-11 - 2018/09/19 (水) 18:08:44 - おお ＞（タンパクは吸着しないで物質はつくという事ですかね？） 不溶性になって凝集したタンパク（タンパクとその物質の複合体）は膜に引っかかるので膜にとどまるということです。ろ紙でろ過するのと同じような原理です。

(無題) 削除/引用 No.7241-10 - 2018/09/19 (水) 17:23:59 - そら uno様 WBでは一つのバンドしかでず、目的の大きさでした。 なので重合体を作って沈殿ではなくチューブの壁に吸着してしまっているのかと思っていました。 もともと分泌されて他のタンパクにくっついて働く性質なので重合体は形成しやすいかと思っていましたが。 変性はしやすい事を考慮してメディウムは回収後すぐにサンプル調整してます。 実験中は全て氷上におき、遠心・振盪も4℃で行なってます。

(無題) 削除/引用 No.7241-9 - 2018/09/19 (水) 17:15:51 - そら おお様 プレ遠心はやってみます！ セルロースアセテート膜は論文読んでみます。 （タンパクは吸着しないで物質はつくという事ですかね？） 物質ではわかりづらいですね、カルシウム化合物です。

(無題) 削除/引用 No.7241-8 - 2018/09/19 (水) 17:00:37 - uno あるタンパク質というのが重合して超高分子を形成する性質のもの、ということはないんですね（チューブリンとかアクチンとか）？ 4℃なら上記の両者とも重合はほとんどしませんが、既に重合していたものが残っていたとか。 あと、非常に変性しやすくて、遠心で一旦取り除いてもその後の操作中に変性してしまう分が出現するとか。 上記の可能性があるなら、buffer条件を変更してみるとか。

(無題) 削除/引用 No.7241-7 - 2018/09/19 (水) 16:21:01 - おお まず、プレで遠心した培地を用意して、実験に取りかかればどうですか？溶けているなら、１３０００ｒｐｍで遠心しても落ちないし、１０００００ｇでも大丈夫。沈降してきたものは細胞のデブリとか何らかの原因で不溶化したものと考えれば。 その後その物質を加えて（加えないものをコントロールにして）実験。 違う方法ですがcellulose acetate membraneはタンパク吸着性がほとんどないので、それでDot blotをすれば不溶化したタンパクがその膜状で検出できるし、実際にそういう実験はある。 ドットブロットができないなら、1.5ml tubeに挿入して遠心できるタイプのものもある。 https://core.ac.uk/download/pdf/82325434.pdf

(無題) 削除/引用 No.7241-6 - 2018/09/19 (水) 15:45:12 - そら すみません、書くのを失念しておりましたが、沈澱分画のWB検出バンドと上清分画のバンドは沈澱のほうが濃かったです。（物質が入っていない物も。） 上清は100µlにsample buffer100µl加えたものを45µl流しています。 0mg/mlの沈澱部分には1×sample buffer200µl加えたものを45µl流しています。 上清は添加物質濃度によらずほぼ一定のバンドの濃さ、沈澱は結果がまちまちなのですが、物質入りよりも物質を入れていない方がバンドが濃かったこともあります。 タンパク量の目安としてポンソーはやってみたのですが、量の指標として入れているBSA以外は検出されていません。 （BSAは上清のみに出ています。） washは試したことがなかったのでやってみます。 すみませんうまく説明ができずに文章がぐちゃぐちゃになってしまいましたが・・・

(無題) 削除/引用 No.7241-5 - 2018/09/19 (水) 15:08:09 - mon あと、WBの感度（精製標品あるいは培養上清の希釈系列、1000倍程度まで）も見ておいた方がよいでしょう。 当たり前ですが、目に見えなくてもWBで検出できますよ。。

(無題) 削除/引用 No.7241-4 - 2018/09/19 (水) 15:04:31 - mon 一回の遠心操作だけだと上清も少量沈殿に含まれますので、再度培地あるいはPBS等に懸濁（あるいは注ぐだけ）＞再遠心してリンス液を捨てる（要はwash)操作を取り入れてもよいでしょう（必要に応じて再度Wash、別のチューブに移して遠心も有効かも)。

(無題) 削除/引用 No.7241-3 - 2018/09/19 (水) 14:15:45 - そら ご返答ありがとうございます。 すみません、わかりづらい文章になってしまっていて。 細胞自体はいただきものなのですが、CHO細胞を遺伝子組換えして目的分泌タンパクが通常より多く産生されています。 その目的分泌タンパクが多く含まれているmediumを使用しているということです。 （また何か変な表現になっていましたらすみません。） 細胞は接着性なのでFBS、ペニシリンを入れないmediumで数日間培養し、そのままmediumを回収後細胞を除くため1800rpm 5min遠心し上清を使用しております。 ご指摘のように遠心による沈澱で起こることでしたら物質混入前に同条件（3500rpm 5min)で遠心した上清を使用すればいいですね。 0mg/mlの方は上清を除くとほぼ何も残らない状態なので沈澱しているというよりもチューブの壁に吸着していると考えてしまっていました。 他にも何かお気づきのことがありましたらお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.7241-2 - 2018/09/19 (水) 13:14:52 - mon 「発現」の使い方が間違っているため文章を理解しがたいですが、「目的タンパク量」のことですか？ 過剰発現すると、正常な高次構造が取れないタンパクが発現したり、分泌タンパクなら糖鎖修飾等が変わり物性が変化することはよくあることです。 問題は、「ある物質を加えていない状態でも、目的タンパクが沈殿分画にある」という結果でしょうか？ 上清と沈澱の分離の仕方が不明なので、適切でない可能性も大きいですが、 これを素直に考えると、「培養上清に目的タンパクが沈殿状態で含まれている」ということではないでしょうか。 そうなると、あらかじめ培養上清を実験条件と同じ方法で上清と沈澱に分けて、その上清を（ある物質と混合する）アッセイに用いれば良いのでは？と思いますが、いかがでっしょうか。

吸着してしまうタンパクのWBについて 削除/引用 No.7241-1 - 2018/09/19 (水) 12:07:00 - そら 今ある蛋白質のある物質（不溶性）に対する吸着性を調べています。 目的のタンパクが過剰発現している細胞培養mediumを使用して、物質を濃度を振り分け振盪し、その上清と沈澱をWestern blotで見ています。 思惑としては物質濃度が上がるにつれ上清での発現は下がり、沈澱は上がるはずなのですが、その物質が入っていないサンプルでも沈澱で発現が認められ、困っています。 タンパクが1.5ml tubeに吸着してしまう性質なのかと思い、低吸着tube、ガラスチューブなども試しましたが変化は特にありませんでした。 どなたかご教授頂けたらと思います。 1.medium（+マーカーとしてのBSA入り）と物質を混和させ4℃振盪（0、0.5、　　1、2mg/ml) 2.3500rpm 5min 遠心 3.上清100µ+2×sample buffer100µｌ 4.上清を全て除き（0mg/mlのものも）沈澱に1×samplebuffer200µl加える 5.96℃、4min denature 6.WB です WBでの検出は出来ています。（上清は濃度に依存せず一定、沈澱もバラつきが多い） mediumは回収後すぐにsampleづくりをしています。 上清と沈澱のタンパク濃度は違っていますが特に問題ありません。 BSAは上清のみに確認されます。（ポンソーにて）

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