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(無題) 削除/引用 No.7237-12 - 2018/09/19 (水) 16:41:05 - おお リコンビナントを抗原にしたポリクロなら溶液の状態で反応する可能性が高いです。IPはできると掲載されていないものは単に試してないだけのこともありますし。

(無題) 削除/引用 No.7237-11 - 2018/09/19 (水) 16:38:41 - おお Protein A/GビーズをつかってIPすればその実験はそれですむのでは？ 少なくとも結合したかは判断できる。

ありがとうございます 削除/引用 No.7237-10 - 2018/09/19 (水) 11:31:58 - ハナムラ 皆様、ご助言ありがとうございます。 抗体は値段を気にして、WBのみ保証されているものを購入しておりました。 また、ご指摘の通り濃度の点も懸念されます。 金属を検出している都合で、血清の方は、希釈できても１０倍くらいですので、大部分のCpを抗体と反応させるには、かなり濃い抗体が必要になりそうです。 先にやった実験ではUVにも元素（銅）の溶出にも、全く変化が見られませんでしたので、結合してカラムにトラップされたという可能性は低いのかと思います。 また、グロブリンが多いので、抗体自体の存在もほぼ見えない状況です。 ダメ元で、思いっきり濃い濃度でやってみて、だめならIP用、ELISA用などの購入を検討します。

(無題) 削除/引用 No.7237-9 - 2018/09/19 (水) 08:21:33 - おお >凝縮 凝縮とかきましたが、凝集といったほうが適切ですね。。。

(無題) 削除/引用 No.7237-8 - 2018/09/19 (水) 06:44:23 - おお コメントありがとうございました。 ImmunoprecipitationをPubmedで検索して古い方から見ていくとflocculation testでてきますね。古すぎて文献は読めないですけど。flocculation test は血清に抗原を加えて凝縮するかどうかみるテストのようですね。

(無題) 削除/引用 No.7237-7 - 2018/09/19 (水) 05:17:29 - 2345y 抗体と抗原を混ぜたときいいかんじの比率のとき大きな免疫複合体が形成されて不溶化して沈殿するのでそれで免疫沈降(immunoprecipitation (IP)の直訳)という名前がついたんだろうたぶんと自分的には長い事、勝手にそう思っておりました。この言葉自体はかなり昔からあるし。オクタロニー法の沈降線とかもそのたぐいじゃないかなと。なんか間違ってましたでしょうか。 じっさい、ポリクロ抗体と抗原分子を含む試料をいい感じの比率で混ぜると濁って遠心したら沈殿に抗原分子がいっぱいありました。抗体が多すぎると分子間を抗体で架橋することがうまくいかないので沈殿はかえってできないので実際濁らなくなります。 で、最適比を探るのは面倒なのと抗体使いまくるので、最近はビーズに抗体くっつけて回収してるんだろうとおもっておりました。ビーズでやるのをIPというのは、たぶんはるか昔からもともとあったIPという言葉がそのまま引き継がれたのかなと。なのでビーズでやるのを免疫沈降（IP)と呼ぶのはなんか違和感あります。immuno affinity purificationとかの方がいいかなとおもいます。イメージ的には抗体によるaffinity カラム法をバッチでやるようなものかなと。

(無題) 削除/引用 No.7237-6 - 2018/09/19 (水) 03:45:31 - おお ＞→ポリクロの場合、形成された免疫複合体がとても大きいと不溶化してしまうことがある（免疫沈降） 細かいことですが、これは免疫沈降と言うのでしょうか。免疫沈降はImmunoprecipitationのことだけを指すと思ったのですが。なにか他に適切な用語がありますか。 もしかしたら抗体抗原複合体のサイズがばらばらでピークがブロードになり検出しにくくなってるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7237-5 - 2018/09/18 (火) 23:11:39 - ２３４５６y 抗体はモノクロですかポリクロですか。 →ポリクロだと大きな免疫複合体を形成する可能性があるので、必ずしも２倍になるとは限らないので、とりあえずはじめは全フラクションを見る必要がある。とくにボイドフラクション（一番始めに出るピークでそのカラムで分画できない大きいものがまとまって出てくる画分）はチェックしましたか？ →ポリクロの場合、形成された免疫複合体がとても大きいと不溶化してしまうことがある（免疫沈降）。そうするとカラムのトップに詰まって出てこなくなる。 対策：反応時の抗体と抗原の量比をいろいろ変えて検討する。免疫複合体の溶解性は横軸に抗体または抗原量をとるとベル型を示すのでどちらかが多すぎても沈殿は生じにくい。 抗体の添付文書には免疫沈降法あるいはFACSに適用可能と書いてありますか。 →書いていないからで出来ないとは限らないけど、ペプチドを抗原として作成した抗体だと、（天然状態での分子内における位置や立体障害などの理由でそこに抗体がアクセスできなければ）免疫沈降に使えないことはよくある。 対策：抗体の適用範囲をよく調べてから買う。

(無題) 削除/引用 No.7237-4 - 2018/09/18 (火) 09:34:30 - おお セルロプラスミンはヒトでは15 - 60 mg/dL 150 - 600 ug/ml ４０uｌ中に４から１６ug https://ja.wikipedia.org/wiki/%E8%A1%80%E6%B6%B2%E6%A4%9C%E6%9F%BB%E3%81%AE%E5%8F%82%E8%80%83%E5%9F%BA%E6%BA%96%E5%80%A4 抗体10ppmって普段使わないからよくわからないが、 １０ｇ/１００００００mlということ？ ならば１０ug/ml、４０uｌ中に４００nｇ 重量比１：１で結合しても全体の２．５から１０％としか結合してないから、フリーのセルロプラスミンをみると結合してないかのようにみえる。抗体は何処に検出されましたか？ また抗体は抗原２分子に結合できる場合も多く、特にポリクロではタンパクが抗体で架橋され凝集したような状態になる場合もあるんじゃないかな。そういう場合は、排除限界にくるか、ゲルに引っかかっているか。 もし計算間違ってたらご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.7237-3 - 2018/09/15 (土) 20:00:31 - mon 抗体が未変性のタンパクに結合しない可能性があります。 ウェスタンブロット用の抗体は変性タンパクに結合することは保証されていますが、未変性のタンパクにも結合すると説明書に記載がありますか。 用途にIP、ELISAと記載されていれば未変成のタンパクに結合すると考えられます。 それでも親和性の問題や（最悪ですが）ロットによって実際には使えなかったりします。

血清中セルロプラスミンと抗体の反応 削除/引用 No.7237-1 - 2018/09/15 (土) 18:41:13 - ハナムラ 初めまして。 生化学の実験を始めて日が浅く基本的なことですが、教えて頂けると幸いです。 ラット血清中のセルロプラスミンに抗セルロプラスミンの一次抗体を結合させたいと考えております。 抗体との結合で分子量が約２倍になるので、サイズ排除クロマトを使って溶出位置のズレを確認したいと思っております。（同時にICP-MSで金属の溶出位置をモニターします） ウェスタンブロット用の抗体(650ppm)を購入し、10ppm、1ppmにPBSまたはTBSで希釈した溶液（計４種）と血清をそれぞれ等量混合（４０μLずつ）、37度で１時間インキュベートしたのですが、クロマトには全く変化なく、セルトプラスミンと抗体が結合している様子は見られませんでした。 操作手順に不適切なところがあれば教えて下さい。 また、血清は-30度で数ヶ月保存しているものを使っております。 サイズ排除における溶出位置から解凍後もセルロプラスミンの分子量はほぼ変化がないように思いますが、凍結することで抗体との結合に影響がでることはありますか？ 何卒、よろしくお願い致します。

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