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293F細胞で分泌タンパク質の産生について トピック削除
No.7232-TOPIC - 2018/09/15 (土) 05:21:38 - ポン吉
293F細胞で分泌タンパク質を産生させています。

約500mlから1000mlの培地を最終的に持つことになりそうですが、スピナーフラスコが大きくないので、何度かに分けてトランスフェクト、培地回収をする予定でいます。

質問させてください。

培地を一回に200mlほど回収予定ですが、保存はどうしたらいいでしょうか?1mMのPMSFは加えようとは思っています。

遠心して、細胞を落としたその上清を4度で保存する予定ですが、この時、濾過した方がいいでしょうか?
できれば凍結はさせたくないです。細胞が残っていたりするとプロテアーゼが心配ですし、バクテリアの繁殖も若干心配です。

ろかする場合はペーパーフィルターではなく、0.45マイクロmのシリンジフィルターがいいでしょうか?
詰まる気がしますが...どうしたらいいのか悩んでいます。あるいは200mlボトル用の0.45マイクロmのフィルターの方が良いのか...アドバイスありましたら教えてください、よろしくお願いします。

1Lの培地を集めるのに、たぶん1月はかかるかもしれません。
 
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No.7232-6 - 2018/09/17 (月) 09:33:51 - mon
0.45umフィルターで濾過するなら、プレフィルター付きを使用するか、もしくはペーパーフィルターで前濾過すると目詰まりが減らせます(0にはならない)。
ペーパーフィルターはそれに染み込む分のロスがありますのでナイロンメッシュ等が良いかもしれません。液量が増えてもよいなら、0.9%NaCl等でフィルターをリンスすると染み込んだ分を回収できるでしょう。
ペーパーフィルター、ナイロンメッシュとも目的タンパクの非特異的吸着を調べるべきです。

(無題) 削除/引用
No.7232-5 - 2018/09/17 (月) 09:27:24 - mon
細胞の残渣は、2~3回「遠心>上清を取る」操作を繰り返すと、沈殿が剥がれて上清中に紛れ込む細胞残渣をかなり減らせます。1回だけだとほとんどの場合不十分です。

(無題) 削除/引用
No.7232-4 - 2018/09/15 (土) 16:34:17 - おお
硫安沈殿できると手短に濃縮できるけど、そんなに大きくないスケールでやってみて活性などに影響ないか確認してはどうかな。

(無題) 削除/引用
No.7232-3 - 2018/09/15 (土) 08:28:35 - mon
DEAE-cellulose等で一回バッチ精製しておくのも良いと思います。
培養スケールは(高価ですが)培養バックを用いると稼げます。

(無題) 削除/引用
No.7232-2 - 2018/09/15 (土) 08:03:52 - mon
こんなことは質問しても正解・保証は得られません。
予備実験するしかないです。想像では保証はないです。
-80℃での凍結が安心ですが、それを採用しない理由に裏付けはありますか?
例えば、凍結融解で失活する、凝固・沈殿する等。無いなら調べるべきです。
活性測定ができないなら、イオン交換カラム法でのプロファイル等でも構造変化はある程度判定できます。
10%glycerol添加で-80℃での凍結も試してください。培養液のpHが変化(低下)している場合もあるので保存状態に不安があるなら、10~50mM HEPESやTrisを加えてpHを安定化させます。
また、培地を集めてから、何をするかで変わるでしょう。安価なprotease inhibitorならEDTAも有用です(培地の成分を考えて濃度を考えてください)。
4℃で保存なら、硫安沈殿状態も安定です。PEG・NaCl沈殿もOK。NaCl等を加えて塩濃度を500mM以上にするのもproteaseの働きが悪くなるので有効だと思います。
不安なら4℃保存も最悪な条件で予備実験すれば良いだけす(例えばわざと細胞を残して37℃保温数日とか:いわゆる加速実験)。
とにかく予備実験です。

293F細胞で分泌タンパク質の産生について 削除/引用
No.7232-1 - 2018/09/15 (土) 05:21:38 - ポン吉
293F細胞で分泌タンパク質を産生させています。

約500mlから1000mlの培地を最終的に持つことになりそうですが、スピナーフラスコが大きくないので、何度かに分けてトランスフェクト、培地回収をする予定でいます。

質問させてください。

培地を一回に200mlほど回収予定ですが、保存はどうしたらいいでしょうか?1mMのPMSFは加えようとは思っています。

遠心して、細胞を落としたその上清を4度で保存する予定ですが、この時、濾過した方がいいでしょうか?
できれば凍結はさせたくないです。細胞が残っていたりするとプロテアーゼが心配ですし、バクテリアの繁殖も若干心配です。

ろかする場合はペーパーフィルターではなく、0.45マイクロmのシリンジフィルターがいいでしょうか?
詰まる気がしますが...どうしたらいいのか悩んでいます。あるいは200mlボトル用の0.45マイクロmのフィルターの方が良いのか...アドバイスありましたら教えてください、よろしくお願いします。

1Lの培地を集めるのに、たぶん1月はかかるかもしれません。

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