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(無題) 削除/引用 No.7231-12 - 2018/10/01 (月) 22:30:43 - ああ おお様 ご返信ありがとうございます。 また、当方の返信が遅くなってしまい申し訳ございません。 やはり、現在の実験系自体に問題があるのかもしれませんね・・ コンストラクトの再設計やTransfectionする細胞の変更も考慮してみます。

(無題) 削除/引用 No.7231-11 - 2018/09/28 (金) 10:04:16 - おお Cell Lysateで検出できないならHAで染めても意味ないです。何処にあるのかわかれば対処方法につながるかもしれないと言うことでした。 いろいろ調べるのはいいのですが、発現させることが目的なら私ならコンストラクトか細胞との相性が悪いと考えて実験系、コンストラクトの再デザインなどに移りますが、、、

(無題) 削除/引用 No.7231-10 - 2018/09/28 (金) 00:44:57 - ああ asam様への返信の続きです。 結局長すぎて、3分割になってしまいました。 asam様のおっしゃるとおり、当研究室は遺伝子の確認がメインストリームでタンパク質の発現の確認には弱いところがあります。なので、この機会に色々基本的なことから勉強しなおして、今後につなげていけたらいいなと考えております。 HRPが付いている抗体でも二次抗体を使ったほうが良いかもしれません。これも次回以降の参考にしようと思います。 この返答で問題ないでしょうか。 文章が長くなってしまい、再度お詫び申し上げます。 Dox無刺激下でのリークの件につきましては、お返事いただけると大変助かります。 ご多忙中とは存じますが、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.7231-9 - 2018/09/28 (金) 00:15:55 - ああ 以下、続きです。 ＞3. バンドが違うとのことだが細胞内（pre-)と細胞外（processed form)は違うが本当にでてないのか？ に関しては、当方がTransfectionしたMMPのタンパク質の質量ですが、pro-formだと50kDaくらい、active formだと45kDaと40kDaくらいです。 Cell lysateを使ったWestern blotでは、50kDaと30kDaくらいのところにDoxの有無で濃淡が違うバンドを確認できました。ただ50kDaのバンドはかなり薄いものでした。30kDaのバンドは濃いものでした。その他の濃いバンドに関しては、200kDaと150kDa付近に2本確認できました。 また、Zymographyでは37kDaくらいに白抜けのバンドを確認できるのですが、Doxの有無で差はなく、EDTAをDevelopment bufferに添加した群でも白抜けのバンドが確認できることから、このバンドはMMPではないと判断しました。その他の白抜けバンドは、100kDa、70kDa、37kDa付近に確認できるのですが、どれもDoxの有無で差は無く、100kDa、37kDaのものはEDTAをDevelopment bufferに添加した群でも白抜けのバンドが確認できるためMMPではないと判断しました。70kDaのバンドに関しては、EDTAをDevelopment bufferに添加した群で白抜けバンドは消失するのですが、Transfection前の細胞でも確認できることから、当方がTransfectionしたMMPでは無いものと判断しました。 細胞培養上清を使ったWestern blotでは、これもCell lysateの時と同様に多数のバンドがみられるのですが、Doxの有無で差がないものの150kDa、100kDa、20kDaで強い発現がみられ、また、同様にDoxの有無で差がなく、かなり弱いですが、60kDa、40kDa付近にバンドを確認しました。ただ、これらすべてのバンドはDoxの有無で違いが無く、また、60kDa、40kDa付近のバンドに関してはMMPの質量に相当するバンドであるもののかなり弱いことから、polyclonal抗体の非特異的な結合だと判断しております。 ＞HAはC末端についてるということでしょうか？ HA-tagの位置に関しては、実を言うとtransfectionをするコンストラクトを作成したのは僕ではないのではっきりとはわかりません。Sequenceのデータがあるのですが、なぜかMMPの配列の末端ぎりぎりまでしかプリントアウトしてノートに貼付されておらず、どちらの末端についているか不明です。コンストラクトを作成した者のノートにはHA-tagがC末端に付いていることを確認したと記載されていますが、基のデータを探しても見つからないので、再度自身でSequenceにかけてみたほうが良いかもしれません。 ＞FBS無しで72時間も培養すると細胞がかなりへたりそうですが、その辺の条件は大丈夫ですか？ に関しては、HA-tagではないものの経験者の方からアドバイスをいただけて、大変うれしく思います。他の論文では（もちろん当方の使用しているMMP、細胞は違いますが、Tet-offシステムを使用したMMP分泌の論文です）24、48、72、96時間と時間をふっていて、72時間以降の発現が強く出ていると報告されていたので、72時間を参考にしていました。確かにFBSが無い分、細胞の活きが落ちると思うので、24、48時間で細胞培養上清を回収し、WBやZymography確認してみます。

(無題) 削除/引用 No.7231-8 - 2018/09/28 (金) 00:12:24 - ああ asam様 早速ご返信頂き、ありがとうございます。 返答の文章がかなり長くなってしまうので、返答を二つに分割いたします。 読みにくくなってしまい、申し訳ございません。 以下、返答です。 ＞1. そもそもtransientの発現ではちゃんと確認できるのか？ に関しては、当方まだ確認しておりませんでしたので、早速行ってみたいと思います。ありがとうございます。ただ、 ＞→ポジコンは確実に出てる条件でやったほうがいいとおもうので、とりあえずtetのシステムでないものを用意してもいいと思います。 に関しては、asam様のおっしゃる通りなのですが、当方の研究室でHA-tagを発現させている他の細胞がないため、とりあえず、Transientの系のみでHA-tagが発現しているか確認してみます。 ＞2. dox誘導は細胞や培地の条件によっては無刺激でもリークする場合もあるがそれは問題ないのか？ に関しては、Doxの無刺激下でのリークは、Transfectionした遺伝子が、Dox有りで発現し、Dox無しで発現しない実験系だけの話だと考えていたのですが、誤りでしょうか？ 当方が使用しているのは、Transfectionした遺伝子が、Doxが無い状態で発現し、Doxが有ると発現しない実験系でなので、その可能性はあまり考えていませんでした。もし誤解をしているようでしたら、ご指摘いただけると幸いです。 また、 ＞doxが死んでないという根拠はないのか？ に関しては、その可能性があるため、細胞培養上清回収のためのwell以外に、qPCRで発現を確認するためのwellを用意し、RNA回収後、逆転写を行い、qPCRで発現量を確認しております。そのとき、Dox有りの群（MMPの発現が抑えられる群）のMmp発現量の上昇が確認されれば、新しいDoxの液へ交換しております。新しいDoxの液というのは1mg/mLで10mL液体を作り、それを分注し、アルミホイルを巻いて遮光した上で-20℃で保存したものです。 ですので、絶対にDoxが死んでないという保障は無いですが、可能性は低く保てているのではないかと思っております。

(無題) 削除/引用 No.7231-7 - 2018/09/27 (木) 10:15:53 - asan 1. そもそもtransientの発現ではちゃんと確認できるのか？ →ポジコンは確実に出てる条件でやったほうがいいとおもうので、とりあえずtetのシステムでないものを 用意してもいいと思います。 2. dox誘導は細胞や培地の条件によっては無刺激でもリークする場合もあるがそれは問題ないのか？ doxが死んでないという根拠はないのか？ 3. バンドが違うとのことだが細胞内（pre-)と細胞外（processed form)は違うが本当にでてないのか？ HAはC末端についてるということでしょうか？ ＞そこで質問なのですが、RNAで発現していても、細胞によってはできたタンパク質が分泌されないことは考えられるでしょうか。 無いとは言いませんが、特殊な細胞のみで分泌されるようなものでは無いMMPのような一般的ながん細胞でも放出するタンパク質がそのような状況になってるのは正直考えにくいと思います。個人的にはtetのシステムが何らかの原因によって悪さしてるだけをまずは疑います。 FBS無しで72時間も培養すると細胞がかなりへたりそうですが、その辺の条件は大丈夫ですか？ MMPではないですが、以前にFLAGtagのtransientな分泌蛋白をstable（限界希釈）,一過性に出して上清からウエスタンをやってたことありますが、過剰発現系ならメディウムを多くしすぎなければ24時間ぐらい経てば上製をそのままSB等に混ぜて直接無理やりWBに持っていってもバンドが見えるぐらいの分泌は見えてましたよ。もちろんFBSはなくしますが。 WBをあまりやらないラボなのかもしれませんが、HRP付きの抗体は感度が低いのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7231-6 - 2018/09/27 (木) 05:26:33 - ああ 先日はこの場でアドバイスを頂き、ありがとうございました。 Cell lysateを使って、Western blotを行ってみました。ウサギのポリクローナル抗体のためかバンドが多数検出できましたが、その中で、Doxの有無で発現量に差がありそうなものが二つありました。内訳としては、当方が過剰発現させているMMPに近いサイズが一つ、それより小さい分子量が一つでした。ただ、MMPと思われるバンドに関してはかなり薄いバンドでした。 この結果と細胞上清の結果を踏まえると、当方の使用している細胞が、 1.遺伝子導入したMMPのRNAからタンパク質を生成していはいるものの、MMPを細胞外に分泌する機構を持たない 2.遺伝子導入したMMPのRNAからタンパク質を生成していはいるものの、それを分解してしまう別の機構が存在する 3.Western blotのバンドが実は偽陽性で、そもそも遺伝子導入したMMPのRNAからタンパク質を生成していない の3つの可能性を考えています。 1に関しては、もしそうであるならば、細胞内に多くのタンパク質が蓄積されているはずなので、Western blotのバンドが薄い理由になりません。 3に関しては、他のタンパク質（少なくとも、細胞が生存するのに必要なもの）は生成されているはずなので、可能性は低いと考えています。ただ、遺伝子導入したコンストラクトに何らかの原因があって、うまく翻訳できないといったことがあるかもしれません。 したがって、現時点では、仮説の2の可能性が高いのではないかと考えております。 免疫細胞染色に関してですが、当研究室で使用しているHA-tagの抗体はすでにHRPがconjugateされているもので、免疫染色を行うためには新しい抗体が必要です。しかし、お金の都合上、新しく抗体を購入できないので、免疫細胞染色は今のところできません。もし、許可が下りれば、購入し、やってみようと考えています。 それ以外で、上記の仮説を証明する方法や他の可能性、あるいは工夫・改良する点等がありましたら、どんなご意見でも構いませんので、アドバイスをいただけると大変助かります。 よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.7231-5 - 2018/09/15 (土) 04:09:53 - ああ おお様 ご回答ありがとうございます。 当方が誤解しておりました。訂正していただきありがとうございます。 確かにそれは良い考えですね！ 早速、抗体を調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.7231-4 - 2018/09/15 (土) 03:23:49 - おお >また、HE-stainingも行ってみます。 あ、言葉足らずで、、、 Anti-HAでImmunostainingをしたらどうかと、、、

(無題) 削除/引用 No.7231-3 - 2018/09/14 (金) 23:57:21 - ああ おお様 すばやいご回答ありがとうございます。 良いアドバイスを頂き、併せてお礼申し上げます。 ちょうど現在、6 well plateで培養している細胞があるので、まずはcell lysateを調整して、おお様のアドバイスを基にwestern blotを行ってみます。 また、HE-stainingも行ってみます。 何かわかりましたらこのトピックに再度返信いたします。 その際はさらにご助言頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.7231-2 - 2018/09/14 (金) 10:16:19 - おお HAで染めてみてはどうでしょうか。細胞表面に出てくるけど放出されないとかいろいろ情報が得られるかもしれません。また細胞のLysatesをWBすることによって発現は確認できるのでは？

トランスフェクションしたMMPの分泌について 削除/引用 No.7231-1 - 2018/09/14 (金) 00:59:33 - ああ いつも勉強のために拝見させていただいております。 前回はMMPのTet-offシステムによる安定発現株樹立の際、ドキシサイクリンの有無で遺伝子発現に差がなく困っておりましたが、皆さんのアドバイスのおかげで、DNase処理を行うことでRNAの発現レベルにおいて、ドキシサイクリンの有無で12倍ほど差がある株を樹立できました。 その節はありがとうございました。 このMMPは分泌型なので、現在その培養上清を使用し、Casein ZymographyやWestern blotなどでMMPの発現を確認しているのですが、ドキシサイクリンの有無で違いが無く、困っております。 現在のプロトコールを記載いたします。 1.Tet-offシステムの安定発現株を100 mm dishでサブコンフルエントまで培養（このときの培地は、DMEM+10%FBS+ドキシサイクリン） 2.トリプシン-EDTAで細胞を剥がし、遠心にて細胞塊を作成 3.PBS(-)を入れ、細胞塊を懸濁し、遠心にて細胞塊を作成 4.Step.3をもう一度繰り返す。 5.ドキシサイクリン無添加のDMEM+10%FBSで細胞を懸濁後、細胞を6 well plate中の2 well に播種（残りはstock用に別培養）。このときあらかじめ、一方にはドキシサイクリンを添加、もう一方は無添加のDMEM+10%FBSを2mL入れておく。 6.4-6時間後、細胞がwell底面に付着したことを確認し、PBS(-)で2回洗浄 7.DMEM+10%FBSにドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、洗浄後の細胞にそれぞれ加える 8.細胞がサブコンフルエントになった時点でDMEMにFBSを加えていないものに、ドキシサイクリンを添加したものと添加していないものを作成し、PBS(-)で2回洗浄後、それぞれの群に加える 9.72時間後に培養上清を回収し、遠心で細胞を除去したのち、スピンカラムで濃縮し、Casein ZymographyやWestern blotに使用。 Casein Zymographyのサンプル調整の際には、還元剤と95℃の熱を加えておりません。また、ネガティブコントロールとして、developmentの時点で一方には10 mMのEDTAを添加しています。developmentの温度と時間は37℃、48時間です。白抜けのバンドはあるのですが、ドキシサイクリンの有無で差が無いこと、およびネガティブコントロールでも出ているので、おそらくMMPでは無いであろうという結論に至っています。 またWestern blotに関しては、当方の使用しているMMPを検出する良い抗体が販売されていないようで、MMPの末端にHA-tagがついているコンストラクトを使用しているので、HA-tagの検出を行っております。バンドは出るのですが、こちらもドキシサイクリンの有無で差が無いこと、および予想しているバンドサイズではないため、これもMMPでは無いであろうという結論に至っています。 本来はELISAが一番適当だと思うのですが、良い抗体が無い関係で行っておりません。 そこで質問なのですが、RNAで発現していても、細胞によってはできたタンパク質が分泌されないことは考えられるでしょうか。もしくはプロトコール中で改善すべきポイントはあるでしょうか。 私個人的には、現在使用している細胞に、トランスフェクションしたタンパク質（今回はMMP）を細胞外へ輸送する経路が無いのではないかと愚考しております。 かなり長文になってしまいましたが、現在かなり困っております。 その方面に明るい方が居られれば、何かしらアドバイスやご意見を頂ければ幸いです。 よろしくお願い申し上げます。

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