BioTechnicalフォーラム [バキュロウイルス発現系を用いたタンパク発現について]

バキュロウイルス発現系を用いたタンパク発現について

No.7229-TOPIC - 2018/09/13 (木) 16:21:57 - えっぺん

いつも拝見させていただいております。

現在、バキュロウイルスを用いたタンパクの発現を行っています。（invitrogenで購入したBac-to-Bac を使っています）

P3までの作製には成功し、Sf21細胞に感染させましたが発現が見られませんでした。

タイターチェックを行わず、1.0×106 cells/mL の細胞密度という条件で行いました。
細胞がはがれるなどの感染兆候は見られましたがタンパク発現は見られないという状況です。

そこで質問なのですが、やはりタイターチェックはしたほうが良いのか
タイターが高すぎると発現に影響があるのかお伺いしたいです。
　

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No.7229-8 - 2018/09/28 (金) 10:06:56 - チャコ

結局のところそのタンパク質は毒性があるのだろう、とのことで発現は諦めました。

それは分泌タンパク質ですか？それとも細胞内タンパク質でしょうか？
私もSf21を使っていました。分泌蛋白質ではSf21の方がよいと言われていますよね。

細胞を遠心してみて、ペレットがやや黒ずんでいたら、きっと毒性があるタンパク質なんだと思います。
ポリヘドロンプロモータなので爆発的に発現しているでしょうから、、、

PE anti-Baculovirus envelope gp64 Antibody
www.biolegend.com/en-gb/products/pe-anti-baculovirus-envelope-gp64-antibody-14445

これでSf21を染めてみるといいかもです。

あるいはプロテアソーム阻害剤等入れて少しでも分解を抑えつつ、P2から精製することもできるかもですね。

(無題)

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No.7229-7 - 2018/09/25 (火) 18:34:34 - えっぺん

チャコさん

回答いただきありがとうございます。
P3以降発現しなかった問題をどのように解決されましたか？
P1のストックまで戻り再度インフェクションを行ったほうがよいでしょうか？

また、現在Sf21細胞を使用していますが、Sf9細胞の使用も検討していますが両者に大きな差異はあるのでしょうか。

(無題)

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No.7229-6 - 2018/09/25 (火) 13:45:25 - チャコ

ウイルスは作ってるのでしょうか？
私はタイターとまでは言えませんが、ウイルスを作ってるかどうかは、昆虫をPE-anti-gp64抗体で染めてました。

私も半年ほど前、P3まで増幅させたら全くタンパクを作らなくなりました。
その時は昆虫の細胞ペレットが黒くなりました。
メラニフィケーションらしいです。

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No.7229-5 - 2018/09/25 (火) 10:32:10 - えっぺん

APさん、Chiroさん

助言いただきありがとうございます。
仰られた通り、１～10000倍希釈まで行いインフェクションしましたが、
発現は見られませんでした。

また、P2の時には低発現でしたが発現していました。しかしP3以降は全く発現しません。

なにかコツなどあるのでしょうか？

(無題)

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No.7229-4 - 2018/09/13 (木) 21:53:15 - Chiro

そもそもp1やp2では発現は見られてました？

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No.7229-3 - 2018/09/13 (木) 17:02:19 - AP

タイターチェックが面倒なら、ウイルス液の希釈系列で感染させたものを何段階か並行しておこなう。