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(無題) 削除/引用 No.7220-13 - 2018/09/21 (金) 08:36:25 - おお フィードバックありがとうございました。pFUSE human IgG2Fc2を作成の際にいろいろと試行錯誤があって、その結果最善のものだったのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7220-12 - 2018/09/21 (金) 08:16:15 - pFUSE おおさん、比べてみました。 タンパク質X-IgG-Fc/pFUSE-hIgG2 Fc2 タンパク質X-IgG-Fc/pcDNA3.1+ 結果は圧倒的に前者の方が多く分泌されていました。 SV40oriを持っていないにもかかわらずです。 びっくりしました。そうなんですね... 比較して良かったです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7220-11 - 2018/09/14 (金) 10:31:07 - pFUSE おお先生！なるほどそういうことなんですね！ 一応私のタンパク質は大腸菌でも機能するので糖鎖修飾などの翻訳後修飾は不要なようです。 まず比べてみますね！ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.7220-10 - 2018/09/14 (金) 10:13:55 - おお 分泌したりする蛋白はあまり強く発現すると、分泌経路に関わるメカニズムがDisturbeされて分泌しにくかったり、細胞が調子悪くなったりと言うことが結構あるようです。また分泌されても修飾などが完成されてないとか、、、pcDNA3.1+でもやってみて比べてみて良い方をというのも手かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7220-9 - 2018/09/14 (金) 07:38:41 - pFUSE 漸くプラスミドが完成したのでCOS7細胞にでも作らせようと思いましたが、これってSV40oriじゃないですね。てっきりこれを使えばエピソーマルに爆発的にプラスミドが細胞内で複製され、高いタンパク質産生効率を期待していましたが、そうではないみたいですね。 なぜでしょうか？ まだトランスフェクションして2日も経ってませんが、同時並行でpcDNA3.1+に乗せ変えようとしています。。。。

(無題) 削除/引用 No.7220-8 - 2018/09/11 (火) 12:00:40 - おお >今まで気にしたことありませんでしたが、LBは10g/lのを使ってて一般的なもんだと 一般的といってしまいましたが、わたしの見てきたレシピは記憶しているものはすべて５g/lだったもので、、、

(無題) 削除/引用 No.7220-7 - 2018/09/11 (火) 10:00:46 - pFUSE mozさん、774さん、おおさん、ありがとうございます。 もうあまりにも形質転換がうまく行かなさ過ぎて、ゼオシンは十分冷めたLBアガーに25マイクロg/mlの濃度で加えました。なので表面に塗るという方法ではないですね。アンピシリンは表面に塗ってます。 そうですよね、ゼオシンは基本低塩LBだと思います。 ただ本によっては低塩LBの塩の濃度が、別の本ではレギュラーな濃度になっていて、、、。 けど、全てLBアガーを自作で行ったところ、信じられませんが一発でうまくいったんです。 それまで1ヶ月は費やしてます。 実際の塩の濃度は2.5g/Lです。 うまくいったので、もうやっとこのストレスから解放されてうれしいんですが、なんだったんですかね...

(無題) 削除/引用 No.7220-6 - 2018/09/11 (火) 09:55:44 - 774 今まで気にしたことありませんでしたが、LBは10g/lのを使ってて一般的なもんだとばっかり。 で、ZeroのマニュアルにLow salt LB（5g/l）で使うよう記載があったので、 特別な時に使うんだろうな。くらいの認識でした。 https://www.invivogen.com/sites/default/files/invivogen/products/files/zeocin_tds.pdf

(無題) 削除/引用 No.7220-5 - 2018/09/11 (火) 09:03:31 - おお http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/6/pdb.rec10789.full?text_only=true Low salt LBとわざわざこだわっているけどきっと通常Molecular biologyでつかう５gNaCl/Lのレシピを使えということだとおもうのだけど、それよりもNaClを減らしたんですか？ 塩濃度が高いほどゼオシンは効きにくくなるだろうけど、許容範囲の塩濃度なら別の要因かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.7220-4 - 2018/09/11 (火) 08:23:40 - 774 Low salt LBでpHを調整して。ていう話だったかも。 うろ覚えですみません。

(無題) 削除/引用 No.7220-3 - 2018/09/11 (火) 08:22:19 - 774 ZeoのマニュアルにLow salt LBを使うように書いてありませんでしたっけ？

(無題) 削除/引用 No.7220-2 - 2018/09/11 (火) 07:14:59 - moz Zeocin溶液を表面に塗っていますか。それとも寒天培地を流し込む前に培地に混ぜていますか。 Zeocinは高塩環境で「沈殿・凝集」するので、表面に濃いめのZeocin液を塗る方法だと、表面だけ高濃度になる可能性があります。

pFUSE human IgG2Fc2 削除/引用 No.7220-1 - 2018/09/11 (火) 05:15:00 - pFUSE pFUSE human IgG2Fc2を購入しましてん。 けど、ライゲーションしても全然コロニー生えねぇし、どないなっとんねんこらぁって感じ。 ゼオシンは新品。 LB培地やプレートはいつもアンピシリン用で使ってるすでにミックスされたもの。 んで気づいたんだがゼオシンって高塩で活性なくなるらしいね。活性無くなることで菌が生えないというのは矛盾してるんだが、まあ一応きちんとやろうってことでLBを構成するペプトンなどを自分で量りとって、塩だけは低塩にしたのね。半分。 そしたら綺麗にコロニー生えてあたりが生じたw なんでだろうね？どう解釈したらいんだろうか。。

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