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(無題) 削除/引用 No.722-8 - 2012/07/13 (金) 23:27:08 - amiたん >APさん コメントありがとうございます。 >大部分が相同組換え修復で元通りになってしまう やはりそうなんですね。 ZFN処理後のbulkサンプルのCel1アッセイで、WTのalleleがかなり残っているのは、ZFN処理をされなかったDNAが残存するだけでなく、homologous end joiningもまた起きていて、その区別はできないということですね。 脱プリンなどのように、Double strand breakも日常でもそこまで頻繁に起きますかね？ ちょっと意外に思いますが。

(無題) 削除/引用 No.722-7 - 2012/07/13 (金) 23:14:40 - AP DSBなんて平常時でも頻繁に生じているもんじゃないですか？ 一箇所や二箇所、DSBができたところで、そうそう細胞死は起こらないと思いますが。それよりも、ZFNがうまく効いて標的配列にDSBができたとしても、大部分が相同組換え修復で元通りになってしまうのがネックでしょう。

(無題) 削除/引用 No.722-6 - 2012/07/13 (金) 02:02:08 - ami ZFNと聞いて思い出したけど、これってDSB入れるんですよね。NHEJが起こる以前に、細胞って死なないのでしょうか？経験おありの方、コメントください 。(良スレの予感)

(無題) 削除/引用 No.722-5 - 2012/07/07 (土) 10:31:18 - AP ラットの場合は、かなり最近までgermline transmission するES細胞ができなかったため、受精卵にZFNを打ちこむ方法が主流になったという事情があります。数年前に使えるES細胞が確立されたので変わって来ていると思いますよ。 ZFNだってデザインから結果を出すまで、そう簡単でも迅速でもないと思いますよ。 相手にする生物に使えるトリックがどれだけそろっているかによるんじゃないですか？(したがって生物種が明かされないとなんとも言えない)

(無題) 削除/引用 No.722-4 - 2012/07/06 (金) 21:09:51 - Harmonia 知人でラット使いの者が、「ラットはBACじゃなく、ZnF nucleaseですよ」 と言っていました。 効率とかコストとか、そういうところはわかりませんが、ある分野では BACを使って目的領域をいじったあとに置き換えることをやっているし、 ある分野ではそれ以外をやっているという感覚でしょうか。 遺伝子発現量の低下が、たまたま見つけた自然変異で起こって いても、ある化合物で起こっても、KOやKDで起こっても同じ。 結局どの方法でも、ポジコンとネガコンをどのくらいの制度で 準備できて、目的遺伝子が原因遺伝子であることの確からしさ を他人に説明できるかどうかのことだと思います。 配列というマジックの種に惑わされないように。 となると、どの方法を使うかの決め手は、どのくらいその 手法に習熟しているか、習熟していないなら、周りから どのくらいサポートが得られるか。 もちろん、どのくらいその手法の原理を理解しているかも 大事と思います。

(無題) 削除/引用 No.722-3 - 2012/07/06 (金) 18:14:32 - ZFN-KO シークエンスを確認して、 フレームシフトが起こっていて、ストップコドンが現れ、 機能的に遺伝子がＫＯされているだろうと判断したクローン（もしくは個体）のみを、 ＫＯとして解析に用いるだけの事です。 もちろん、どこにＺＦＮを作用させるか（ターゲット配列）が重要なのは 言うまでも無いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.722-2 - 2012/07/06 (金) 18:12:38 - KY KOでも欠損できるゲノム領域はその遺伝子のエキソン１〜数個しかできません。 そのため、発現してもフレームシフトするように設計したりしますが、それでもたまに、トランケートの目的産物が発現してしまうことがあるそうです。また重要なドメインを欠損させれば、確実に機能が欠損しますが、非機能的なＮ末端が発現していることは良くあると思います。 zinc finger nucleaseも結果としてタンパク質発現が欠損することになるので、ＫＯの部類に入ると思います。 私自身はzinc finger nucleaseを使用したことありませんが、知り合いが良い結果を出していました。ただどのくらいの成功率なのかなど実際の詳しいことは知りません。 確実にＫＯマウスが必要、Loxpなどを使用して組織特異的ＫＯが必要になるかもしれない、などあればＫＯマウスを作製をしたほうがいいでしょう もし金銭的にかなり余裕があり、新しい技術を試してみたい、早くＫＯマウスを作る必要がある、自分のラボでも知り合いにも一般的なＫＯマウスを作製したことがない、などの理由があれば、zinc finger nucleaseを試してみるとようでしょう。

遺伝子ノックアウト法について 削除/引用 No.722-1 - 2012/07/06 (金) 14:52:04 - pon吉 みなさまお世話になります。 一つみなさまの考えをお聞かせください。 gene targetingで、ある個体の遺伝子改変マウス等を造る際、homologous recombinationにより目的の遺伝子を機能欠失ものに換えるのがこれまでの主流でした。 この際には転写されないようにその領域を欠失させることでmRNAレベルでもタンパク質レベルでも欠失できるかと思います。 また、RNAiなどにより興味ある遺伝子の3'UTRに特異的に結合すれば、遺伝子のノックダウンが可能になります。 ここでひとつ疑問なのですが、zinc finger nucleaseのようにDSBからの修復を利用したmutagenesisはindelsのmutationを引き起こしますが、この場合にはノックアウトと言えるのでしょうか？ truncated formのものができたり、mutantでも充分機能を発揮してしまうものも出てくるかと思います。この点に関して今後ノックアウト動物を作製するにあたり、これまでのhomologous recombinationを使ったもので行うべきか、ZFNで素早く作製してしまうのが吉がどちらなんでしょうか？トピックが本HPの趣旨に合わないとご指摘いただければ削除いたします。 みなさまのご意見をお聞かせください。

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