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(無題) 削除/引用 No.7212-17 - 2018/09/19 (水) 00:22:56 - BB FastCloningっていうやつですよね。 https://blog.addgene.org/fast-cloning-a-newer-simpler-cloning-technique DpnI処理するとか、PCRサイクル数を減らすと、効率が上がるようです。 他にも類似の論文が山ほど（本当にたくさん）出てたはずです。 50℃保温が効果があるなら、「改変法」として面白いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7212-16 - 2018/09/18 (火) 20:33:23 - toto > In Fusionクローニングは酵素なしでもできますよ 衝撃。これって、よく知られたことなのですか？今度やってみます。

(無題) 削除/引用 No.7212-15 - 2018/09/17 (月) 21:50:14 - ねずみ In Fusionクローニングは酵素なしでもできますよ（In Fusionクローニングと言っていいのかわかりませんが）。大腸菌の抽出液とかも一切使いません。 ベクターとインサート（両端に15 bpのオーバーラップ）だけ混ぜて50℃インキュベーション（この操作が必要か不要かは未検証）、トランスフォーメーション、これだけです。DH5-alpha、XL-1 blueで試したことがあります。出てくるコロニーの数は酵素を使った場合の1/10程度ですが、当たり率は8割程度（シーケンスも確認）、コストも労力もほとんどかかりません。 大腸菌の修復系によるものと勝手に想像しています。

上手くいってますよ 削除/引用 No.7212-14 - 2018/09/17 (月) 12:02:47 - かなだ 実際に試した価値はありました。Gibson assemblyと比べると効率は10ー100倍以上落ちるようですが(同じラボの友人談)、二断片のクローニングなら、実用上十分な効率でクローニング出来ています。三断片を繋いだ際は、効率よく出来た時もあるし、上手くいかなかったこともあります。なんたってコストパフォーマンスが良いし、クローニングの自由度も高いし、バックグラウンド低いし、ベストではないかもしれないけど必要十分な効率だし、とても気に入っています。

(無題) 削除/引用 No.7212-13 - 2018/09/09 (日) 20:43:20 - moz どこかで拾った文です。Sigmaの液は自作できますよ、多分。 This example sets forth results that compare a zwitterionic detergent combination of the present invention with a commercially available lysis solution, CelLytic B (Sigma-Aldrich Co. Product No. B3553). This reagent contains 1% (w/v) octyl-β-D-thioglucopyranoside, with a Tris buffer, 40 mM Trizma® HCl(pH 8.0). CelLytic B 1% (w/v) octyl-β-D-thioglucopyranoside 40 mM Tris HCl(pH 8.0)

(無題) 削除/引用 No.7212-12 - 2018/09/09 (日) 19:14:30 - 抽出液 開発者の先生がsigmaの可溶化バッファーと Triton Xバッファーを比較した論文を出されていますが、やはりシグマのバッファーの方が効率が良さそうですね。 下記の掲示板も興味深いです。 https://togetter.com/li/872250 https://www.flickr.com/photos/fumihirokawai/21267456540/in/photostream

(無題) 削除/引用 No.7212-10 - 2018/09/09 (日) 08:53:42 - moz > in fusionクローニングは3'→5'のエキソヌクレアーゼであり、大腸菌の中でアニーリングとライゲーション、プラスミドの構築が行われると私は勝手にイメージしており、 わたしは、大腸菌外でアニーリングまで行われると思っています。菌体内に取り込まれてから、fill-in, ligation反応で修復されると思っています。 回復時間は、主に薬剤耐性遺伝子の（十分な）発現に必要な時間だと思います。

(無題) 削除/引用 No.7212-9 - 2018/09/08 (土) 17:40:59 - 貧乏人 あかねさん monさん ありがとうございます。 > 諦めきれないので、なんとか効率をあげれないかと思っています。 Gibson Assemblyは使ったことがないのでわからないのですが in fusionクローニングは3'→5'のエキソヌクレアーゼであり、大腸菌の中でアニーリングとライゲーション、プラスミドの構築が行われると私は勝手にイメージしており、回復培養20分を必ず行っています。 （in fusionのプロトコールには回復培養は必ず行ってください　と記載されています） SLiCEプロトコールには回復培養について触れられていないのですが、回復培養の導入はいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7212-8 - 2018/09/08 (土) 17:05:45 - mon > 諦めきれないので、なんとか効率をあげれないかと思っています。 Ligationの促進剤みたいに、反応液に終濃度5% PEG6000を添加してみてはダメですかね。 たしかGibson Assemblyにも添加されていたと思います（NEBuilderは不明）。

(無題) 削除/引用 No.7212-5 - 2018/09/08 (土) 12:23:20 - あかね ちょうど、先週自作して使ってみました。 同じDNA(切断したプラスミドとPCRしたインサート)を使って、一方はGibson Assembly (NEBuilder 2ul, total 4 uの系l)、もう一方はSLiCE (total 5 uの系）で反応して、transfromationしてみました。 SLiCEでコロニーは生えるものの、Gibson Assemblyの方がコロニーの数は10倍程度でした。 諦めきれないので、なんとか効率をあげれないかと思っています。

(無題) 削除/引用 No.7212-4 - 2018/09/08 (土) 11:27:48 - 貧乏人 プロトコールはこちらです http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~motohas/motohashi_lab/oyakudachi_others_SLiCE.html https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9601/9601_yomoyama.pdf 実験医学2016年9月号 (vol.34, No14)｢クローズアップ実験法｣

SLiCEクローニング（自作 in fusion酵素） 削除/引用 No.7212-1 - 2018/09/08 (土) 11:20:50 - 貧乏人 seamlessクローニングの代表として、タカラバイオのin fusionクローニングがありますが試薬の反応コストが高いことがデメリットだと思います。 （説明書通りに行うと１反応２０００円。） 最近、京都産業大学の本橋先生が開発されたSLiCE (Seamless Ligation Cloning Extract)方が実験医学などで特集されています。 JM109などの大腸菌から得た細胞抽出液を用いてin fusionとほぼ同等のプロトコールでseamlessクローニングを行えるというものです。 ￥0.4 Yen / reactionと非常にコストパフォーマンスに優れていると言われています。 試してみようと思っているのですが、 もし実際に試された方などいらっしゃいましたら感想を教えていただけませんでしょうか。 よろしくお願いします。

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