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(無題) 削除/引用 No.7211-10 - 2018/09/10 (月) 08:04:28 - omochi おお様 moz様 アドバイスありがとうございます。実際、pH2.0でかなりの生細胞が死滅してしまったので、強酸や強アルカリは細胞に対しharmfulということで避けたかったところでした。お二人のアドバイスにて再度実験してみます。本当にありがとございます！

(無題) 削除/引用 No.7211-9 - 2018/09/09 (日) 08:48:10 - moz > なぜ塩をおすすめされたのか教えていただけますと幸いです。 酸・アルカリ・界面活性剤は細菌の細胞膜を障害しますので、細胞膜への作用がよりマイルドと思われるだけです（浸透圧の影響はあります）。高濃度Mgなんかは大腸菌のコンピテントセル調製にも使われますし。ただしそれ以上の根拠はありません。 FACSへの影響はわかりませんが、1~20%DMSOをさらに添加しても良いかもしれません。10%DMSOは培養細胞の凍結液にも使われますので短時間なら細胞膜の障害も少ない（復帰する）と思います。 抗体と抗原の相互作用は、疎水性結合・イオン結合・ファンデルワールス結合・水素結合と言われていますのでそれらを阻害するか、それら引き起こしている分子（アミノ酸残基）の位置関係（タンパク高次構造）を壊せば、外れます。 DTTなどの還元剤も良いかもしれませんが、抗体のS-S結合を切るには結構高濃度で使用するので、影響は不明です。

(無題) 削除/引用 No.7211-7 - 2018/09/09 (日) 07:06:06 - おお プロテアーゼと漠然に書きましたが、具体的にはトリプシンやそれよりマイルドに調製されたトリプシン様プロテアーゼが哺乳動物細胞の培養でDishから生細胞のまま剥がすために用いられています。哺乳動物細胞に対してはプロテアーゼ活性の毒性が最小限に抑えられるので細胞によってはよく使われます。 ということで、細菌に関しての知識はありませんが一つの候補としてトリプシン様プロテアーゼとしてTrypLE™ Express Enzymeをあげときます。細胞培養ではよくフェノールレッドを加えた溶液を使いますので、下に示した商品以外にフェノールレッド入りでオレンジ色をしたものも売られています。ダウンストリームで蛍光などの検出を考えているようなのでもし使うなら無色のものがいいのではと思いました。 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12604013

(無題) 削除/引用 No.7211-6 - 2018/09/09 (日) 03:14:43 - omochi mozさま 情報ありがとうございます。酸溶出やアルカリ溶出もあるなか、なぜ塩をおすすめされたのか教えていただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.7211-5 - 2018/09/08 (土) 15:05:59 - moz www.learningatthebench.com/optimization-of-affinity-purification.html で、バクテリアに使えそうなのは、 3.5 M 塩化マグネシウムまたは塩化カリウム 0.1 M トリス酢酸, 2.0 M 塩化ナトリウム, pH 7.7 あたりかな？

ありがとうございます 削除/引用 No.7211-4 - 2018/09/08 (土) 14:01:18 - omochi おお様 アドバイスありがとうございます、参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.7211-2 - 2018/09/07 (金) 05:06:20 - おお プロテアーゼとかつかえないのかな。消化管を通ったようなバクテリアならそこそこ耐性もあるような気がするし。

糞便中バクテリアの抗体分離 削除/引用 No.7211-1 - 2018/09/07 (金) 00:56:57 - omochi 糞便サンプル中のバクテリアの抗体を分離し除去、そして抗体を持たないバクテリアのみ得るべく実験を行っています。0.1M glycine-HCl buffer（pH2.0)でバクテリアを１分程度インキュベートしその後洗浄してからFACSで調べるとバクテリアの抗体は残存したまま、むしろ0.1M glycine-HCl bufferを使っていないサンプルよりMFIや%positiveが高い結果となってしまいます。抗体精製に関する方法は見つかるのですが、今回は抗体はむしろ除去したいものなので、バクテリアから分離できさえすれば良いのですが...どなたかご経験などアドバイスいただけないでしょうか。

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