BioTechnicalフォーラム [ウエスタンの洗浄時間について]

ウエスタンの洗浄時間について

No.7199-TOPIC - 2018/09/04 (火) 15:42:09 - うえすたーん

本日、ウエスタンプロットの一次抗体反応後の洗浄の際に、都合により、室温でオーバーナイトするつもりです。

ウエスタンの洗浄は長ければ長いほど良いことはあるのでしょうか。洗浄のし過ぎによる影響など何か考えられるものがあればお教え願います。
　

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No.7199-12 - 2018/09/05 (水) 03:15:52 - おお

>10~15分を３回くらいが一番多い気がする。
>BGが高いのは一生懸命洗ってもあまり改善しない。

同じような感覚もあるのですが、10~15分を４回にするだけでバックグランドが弱くなるという経験もありますね。サイドバイサイドでないので感覚としてですけど。
わたしは洗いに関してはかなり適当で、他の実験の合間にやっていてその実験の都合で半日洗いっぱなしで気が向いたら洗浄液（PBST）を交換していることもありますので５、６回洗っていることがおおいです。たまたま10~15分を３回と標準的なやり方をすると結構バックが高かったりする事もしばしばです。

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No.7199-11 - 2018/09/05 (水) 02:19:47 - １２３４

10~15分を３回くらいが一番多い気がする。昔は30分x3回でやっったけど、わかるような違いはない。調子にのって3分３回やったらやっぱ汚かったけど、長過ぎて取れた経験はない。
avidityは抗体それぞれだけど、抗原抗体複合体は生物学であつかう結合の中では強い部類で、SDS＆低pHでストリピングしてもまだ残っている抗体もたまにあるので、強いのはかなり強固なんだとおもう。

BGが高いのは一生懸命洗ってもあまり改善しない。ブロッキング剤を変えてみることで改善できる余地があるとおもうけど。ていうかBGが汚いのはそもそも抗体そのものが良くないことが大半なので、そんな抗体のために苦労して条件ふるのもどうかとおもうので、BGが汚くない抗体に変えた方がいいです。

いままで経験した範囲では低温、常温どっちでも変わらない。なかには温式抗体、冷式抗体もあるので、違いがでることもあるとは思うけど、レアケースのような気がする。

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No.7199-10 - 2018/09/04 (火) 19:37:48 - AP

あと、プロット plotじゃなくてブロット blot

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No.7199-9 - 2018/09/04 (火) 19:36:18 - AP

抗体はくっついたらくっつきぱなし、だと思ってるんじゃないかな？
化学で習う結合と解離の平衡ですからね。
Ab + Ag <――> Ab・Ag
Abの濃度が下がれば平衡は左側にずれます。

他にも指摘があるように、一次抗体でo/nするのはよくやります。
この時、短時間で反応させる時より抗体濃度を薄めに設定することもあります。
濃度は反応速度のパラメータで、長時間時間をかけられるのなら濃度を下げられます。
逆に高濃度で時間を引き延ばし過ぎると、反応速度が遅い非特異的反応も上がってくるおそれがあります。

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No.7199-8 - 2018/09/04 (火) 19:24:17 - AP

その抗体と抗原のKd値によります。Kdの高い抗体なら抗体濃度の低い外液(洗浄液)につけておくと、抗体の解離が進み強度が著しく低下する危険があります。

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No.7199-7 - 2018/09/04 (火) 16:49:41 - おお

一次抗体の反応を４度（コールドルームなどで）オーバーナイトという選択肢もあるにはある。シグナルは強くなることが多いが、バックやエクストラのバンドが目立つことも多々ある・

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No.7199-6 - 2018/09/04 (火) 16:46:37 - おお

＞一時抗体の洗浄が剥がれてやり直す際は、

同じ抗体ならストリッピングは必要ないとおもいます。そのまま一次抗体の反応をやってもいいですけど、私なら念のためブロッキングしてから一次抗体の反応にうつります。

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No.7199-5 - 2018/09/04 (火) 16:43:36 - おお

>ウエスタンプロットの一次抗体反応後の洗浄の際に、都合により、室温でオーバーナイトするつもりです。

私なら洗浄液につけてコールドルームか冷蔵庫に入れておくかします。抗体の親和性の高いもの、発現量が強いものなら翌日洗浄、２次抗体と進めていっても検出できることは多々あります。ただしあなたの使っている抗体と検出などの環境も分からないですし保障はしませんし、検出という点ではできること多いですけど、実験によっては検出できても不都合があるかもしれません（検出感度がふだんよりかわるとか）。

＞ウエスタンの洗浄は長ければ長いほど

長いほうがバックグランドが低くなるというメリットはありますが、目的のバンドの強さがどの程度維持できるかというのもあるので抗体や使っているサンプルや実験で何を調べたいかによっては支障があるかもしれません。

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No.7199-4 - 2018/09/04 (火) 15:47:52 - うえすたーん

一時抗体の洗浄が剥がれてやり直す際は、抗体のストリッピングバッファーで完全に抗体を落とした後、ブロッキングからやり直すべきでしょうか。それともストリッピングの後、一時抗体に入っても良いのでしょうか。

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No.7199-3 - 2018/09/04 (火) 15:45:53 - うえすたーん

なお、洗浄は1×TBSTで室温、ほんの少し震盪させています。

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No.7199-2 - 2018/09/04 (火) 15:45:37 - う

やはり抗体はどんどん鬼のように剥がれて行くと思います。