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(無題) 削除/引用 No.7185-8 - 2018/09/02 (日) 12:54:28 - AP ドナーはGFPに関してホモ接合でしょうか。 ヘテロ接合だとLOHの可能性もあるかも。

(無題) 削除/引用 No.7185-7 - 2018/09/02 (日) 11:56:18 - KOHAKU asan様 　血球系マーカーに関してですが、laboにあった抗体でCD45, CD11b, B220, Cr-1では末梢血サンプルで行いましたが、同様の結果でした。その他T- cellのマーカーでうまく組み合わせられるものがなく、追加で検討すべきか悩んでいます。また造血細胞等での検討はできていないため、検討しご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.7185-6 - 2018/09/02 (日) 11:46:45 - KOHAKU asan様 Mac様 AP様 　ご多忙のところご返信いただき誠にありがとうございます。 本実験ですが、NGSの解析で疾患特異的にある変異がみられ、その変異を導入したマウス骨髄と変異がないlittermateの骨髄を競合移植して、変異ありの方がより優位に増殖するとの仮説を立てております。増殖力に大きな差が予想される変異でないため、なるべく背景が同じマウス骨髄を移植する必要があると考え、littermateでの移植を行い、Nを増やして解析することを予定しております。 本研究も上記の目的ですが、コンジェニックラインの移植に変更して検討することが可能でしょうが！？ GFPに関してですが、マウスの作成を別の研究室にやっていただき、その際にGFPも導入していただきました。現在GFP領域のプライマーが手元にあり、GFPの有無の確認はバンドでのみ行っている状況でして、それ以外の情報がなくGFPマウスの詳細は確認できませんでした。週明け早々に上司と、マウスを作成いただいた研究室に問い合わせさせていただきます。 またB6 (GFP＋ 変異＋)とB6 WTをmatingしてるためGFPは全例ヘテロとなっています。個体による違いは数％のため私のFCMの技術不足かもしれません。 GFPー コントロールと比較してGFP＋のピークは２−３logはなれていますが、約１割の細胞が１−２logに散在している状況です。 何卒ご指導のほどよろしくお願い申し上げます。

GFPでのキメリズム解析 削除/引用 No.7185-5 - 2018/09/02 (日) 11:08:25 - KOHAKU

(無題) 削除/引用 No.7185-4 - 2018/09/01 (土) 14:22:25 - AP プロモータは何で、どのようにしてゲノムにインテグレートしてその場所はどこか？ 最近ではシングルセルでRNA-seqができたりして、それでわかってきたことは、同一個体で同一細胞種でも、個々の細胞で発現プロファイルがずいぶん異なることもあるようだ。 エピジェネティクスが流行りで、一般にはDNAのメチル化と同義のように思われがちだが、いろいろな機構のエピジェネティクスがある。例えばユークロマチンとヘテロクロマチンの境界付近の遺伝子は、一個体の中で発現したりしなかったりでモザイクになる（position effect variegation)。

(無題) 削除/引用 No.7185-3 - 2018/08/31 (金) 22:09:41 - Mac GFPマウスのプロモーターは何でしょう？　造血系特異的にGFPを発現するのか、あるいはもっとユビキタスに発現するマウスでしょうか？ 個体による違いというのは、例えばホモとヘテロで違うとか、そんな感じですか？ FCMでは、GFP陽性と陰性の細胞のピークは綺麗に分かれる、すなわち、95%の陽性細胞から見て、２ログくらい離れたところに5%の陰性細胞ピークが見られる感じでしょうか？ アロの移植モデルのようですが、コンジェニックではなくGFPを使う事と、何か関係ありますか？

(無題) 削除/引用 No.7185-2 - 2018/08/31 (金) 17:06:06 - asan Germlineに乗った場所によっては発現されないような領域にGFPが入ってる細胞がいるんでしょうか？ 血球系マーカーや、造血細胞等を回収してゲーティングかけてGFPの割合がどうなるかは見ましたか？ この手の実験をするなら通常コンジェニックラインを使うのがベターですよ。 ちなみにcompetitorなしでwholeの骨髄細胞の移植ですか？

GFPでのキメリズム解析 削除/引用 No.7185-1 - 2018/08/31 (金) 10:40:16 - KOHAKU 　マウス骨髄移植においてGFPでのキメリズム解析を試みております。その前段階としてドナーとなるGFP陽性マウス血球をFCMで検出しても、個体にもよりますが、GFPの発現レベルに幅があり、GFP陽性血球は90−95％で100％陽性とならず難渋しております。FCMでの解析では赤血球をしっかりと除去したのち、PIで死細胞を除去して、Linageごとでの解析を行っております。GFPはGerme lineのハズなので理論上は100％GFP陽性となると想定していましたが、いかがでしょうか。 100％陽性とする方法がありましたらご教授いただけないでしょうか。 なお、移植モデルとしてはBALB/CにTBI 8Gyを前処置として、B6 GFP＋とB6 GFP-を競合移植してキメリズム解析を行う予定です。 何卒ご指導ご鞭撻のほどよろしくお願い申し上げます。

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