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(無題) 削除/引用 No.7182-16 - 2018/08/31 (金) 08:04:30 - moz ねずみさん、 そうなのですね。情報ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7182-15 - 2018/08/30 (木) 23:47:46 - ねずみ > 1.5kbのssDNAを受注しているところはないと思います。 ありますよ。少なくとも私は2社知っています。ただし、オリゴのように合成するのではなく一旦プラスミドにクローニングし、それをもとに1本鎖を作製するという方法。なのでプラスミドとして納品するよりも価格は高いし、収量もそれほど多くもなく、クローニングが目的ならプラスミドとして納品してもらうのが現実的でしょう。 プラスミドではなく直鎖の長鎖2本鎖DNAを作製してくれるところもあります。PCRの鋳型として利用できます。プラスミドへのクローニングよりも少し安い。

(無題) 削除/引用 No.7182-14 - 2018/08/30 (木) 15:38:27 - AA 1.5kbpを人工遺伝子合成で頼むのであれば、 プラスミドに入って届く可能性が高いので、 追加料金を払えば指定プラスミドにクローニングしてもらえますね。 各社あるけど2,3万円くらいだと思います。 最近はかなり安い(1bp=30円前後)サービスもあるので 差額で任意のプラスミドへのクローニングをしてもらうのはありかと思います。 Thermoみたいな大手でも結構安いです。 なお、gBLOCKsみたいな製品の場合は断片で来ますから、 制限酵素をつけといて自分でサブクローニングして、 産物をシークエンスチェック、という流れになりますね。 ssDNAでも2kbpくらいまでなら受け付けているところもありますが、 それはそれ用のサービスで特殊なので、一本鎖が届くことはまず無いと思います。 (もしあれば実験で使いたいので教えてほしいくらいです。。。)

(無題) 削除/引用 No.7182-13 - 2018/08/30 (木) 13:43:13 - AP たぶん、通常の固相合成でそこそこの長さのssDNAを合成する。遺伝子全長を相補鎖間で交互になるように、末端がオーバーラップするssDNAでカバーする。あとはoverlap extension PCRの原理。

(無題) 削除/引用 No.7182-12 - 2018/08/30 (木) 13:14:08 - ふと 人口遺伝子合成ってつまるところ、長いバージョンのプライマーを作るのと同じ原理で作ってるんですかね？ たとえばTリッチなものは合成できんとかpreferentialなものってありますですかね？

(無題) 削除/引用 No.7182-11 - 2018/08/30 (木) 12:43:43 - AP >1 bp 50円くらいが底値か。 これくらいだと、普通のオリゴDNAの単価と変わらないくらい。 オリゴDNA合成サービスで仮に1.5 kb合成できたとして、相補鎖を合成すると倍の値段になるわけだから、人工遺伝子合成はかなりお値打ち。

(無題) 削除/引用 No.7182-10 - 2018/08/30 (木) 11:49:04 - 774R >PCR反応でアニールしてるのはプライマーでは？？？ プライマーもアニールしますが、PCR産物同士もアニールますよ？ 特にサイクルの後半でPCR産物量が飽和してる状況においては、新規合成はほとんど起こらず、PCR産物がディネイチャーと再アニールを繰り返してるだけになってますから。

(無題) 削除/引用 No.7182-9 - 2018/08/30 (木) 11:23:36 - AP そもそも1.5 kbもあったらもはやオリゴとは言えない。 合成機で合成できるのは長くても150 ntくらい。実用的なのは80 ntくらいまでじゃないかな。 1.5 kbとなると人工遺伝子合成というサービスになる。二本鎖DNAがプラスミドに組み込んだ形で納品、あるいはそのままの形で納品してくれる場合もある。 納期、価格も各社いろいろだけど、1 bp 50円くらいが底値か。

(無題) 削除/引用 No.7182-8 - 2018/08/30 (木) 10:58:09 - ちょっと待って？ >[Re:7] asanさんは書きました : > > 通常のPCR反応でアニールしてるのだから長くても問題なくアニールすると思いますよ。 PCR反応でアニールしてるのはプライマーでは？？？

(無題) 削除/引用 No.7182-7 - 2018/08/30 (木) 09:52:38 - asan 通常のPCR反応でアニールしてるのだから長くても問題なくアニールすると思いますよ。 その意味で言えば、sticky end を作って置いてあらかじめ切ったDNAに入れるのが楽かもしれませんが、そんな長いsticky endを含むDNAを作ってくれるのかは疑問ですから1.5kのブロックDNAを足場とともに合成してもらってクローニングになるのではないかと思います。 いずれの方法であれ、自分でクローニングした場合は合成時に一部混入してるかもしれないエラーが存在しないことをシーケンスで確認する必要はあるのではないかと思います。直接ベクターに挿入してもらうオプション等で依頼した場合やそれから切り出してそのままライゲーションすればこのステップは省けるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7182-6 - 2018/08/30 (木) 09:43:09 - PYK 直接関係ないかもしれませんが、通常のプレップでとったpEGFP-Nベクターは、XbaIサイトが使えませんよ。

(無題) 削除/引用 No.7182-5 - 2018/08/30 (木) 06:32:56 - moz 発注するときに、そのままの配列だけでなく、発現量が多くなるように（生物種に合わせた）コドン最適化や望まない制限酵素部位の削除なども可能ですので、上手に利用すると良いです。

(無題) 削除/引用 No.7182-4 - 2018/08/30 (木) 06:25:02 - moz 1.5kbのssDNAを受注しているところはないと思います。dsDNAの間違いではないですか。 （1）plasmidにクローニングした状態（シークエンス確認済み）か、（2）その前段階にdsDNA（PCR産物のような状態：mix状態でシークエンス確認済み）のハズです。ご確認ください。 そのため、（経験がないことを考えると）制限酵素部位を付加した配列で（1）の状態を発注し、通常のサブクローニングのように実験を進めるのがベターです。

(無題) 削除/引用 No.7182-2 - 2018/08/30 (木) 04:21:09 - おお 合成遺伝子で各社ベクターに挿入して配列を確認後ユーザーに届けるサービスはありますので、出入りの業者さんなどから取り扱っているところを聞いてみるといいかもしれません。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis.html https://www.genewiz.com/Public/Services/Gene-Synthesis/TurboGENE?sc_device=Mobile

1.5kbオリゴをプラスミドにクローニングする方法 削除/引用 No.7182-1 - 2018/08/30 (木) 01:37:58 - おりごん お世話になります。 人口遺伝子として1.5kbほどを外注で合成したいです。 その後、pEGFP-N1にクローニングしたいです。 この時、BamH1, Xba1サイトを利用します。 2つ質問させていただいてよろしいでしょうか？ ＃１ 1.5kbの両端にこれら制限酵素サイトを持たせておいて、届き次第アニールして、制限酵素でカットし、スピンカラムで精製してクローニングするのが良いのか、それともそもそもオリゴの時点で制限酵素で切断した後のデザインにしておいて、届き次第アニールしてすぐにライゲーションした方がいいのかどちらでしょうか？ ＃２ 1.5kbもの巨大なssDNAを外注したことすら初めての経験です。 これって簡単にアニールできるものでしょうか？ たとえば2つの相補的なオリゴを混和し熱湯の入ったビーカーに入れ、室温に冷めるまで放置しておけばアニールされますか？ なにぶん初めてのもので質問ばかりで恐縮しておりますが、よろしくお願いします。

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