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(無題) 削除/引用 No.7178-14 - 2018/08/29 (水) 14:30:48 - シャペロニン ＞MMMさん ありがとうございます。 ＞かなり早い段階での確認も必要 やはり1-3日全てで確認した方がいいですかね？今日やってみた感じ3日での同定は失敗のようで、再チャレンジしてみようと思ってます。 ＞1/3の部分がシグナル配列 両末端どちらも残っているようで、真ん中がシグナルだったという例がないか探してみようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.7178-13 - 2018/08/29 (水) 14:19:48 - シャペロニン ＞おおさん ありがとうございます。欠損株を調べてみます。 ＞おそらく削れているっぽいので・・・ それがどちらの末端もあるみたいで、バンドも確認済みです。 どうやら真ん中がなくなっているみたい・・・？ ＞大腸菌では分泌システムが働かない可能性はないですか？それともその放線菌で発言させたのかしら？ どちらを宿主とした場合でも上清では分泌が確認されませんでした。。 Hisタグの影響を受けている可能性しか今のところ考えられていません。。

(無題) 削除/引用 No.7178-12 - 2018/08/29 (水) 11:08:53 - MMM 放線菌ではないけど、昔グラム陽性菌を扱った経験からすると、溶菌しているのかもしれません。 特にこの辺りの記述が気になります。 > それは細胞内の大きさとは異なり、約2/3の大きさです。 > 溶菌による漏れの可能性を排除したいのですが、今のところ早い培養段階での確認(培養3日、Full growthは5日)しか行えていません。培養3日では再現性はとれそうです（現在遂行中）。 Full growthになる前に死ぬ菌が大量に出てくるので、かなり早い段階での確認も必要だと思います。ただ、目的タンパクがクオラムセンシングにも関わってたりすると、早い段階では判断できないので難しいですね。 > それは細胞内の大きさとは異なり、約2/3の大きさです。 1/3の部分がシグナル配列だった...ってことはないですかね。

(無題) 削除/引用 No.7178-11 - 2018/08/29 (水) 02:52:35 - おお バクテリアだったんですね。 mozさんが示しているこれまでに2つの膜透過装置（Sec膜透過装置とTat膜透過装置）と7つの分泌装置についてそれらを阻害するとか欠損株があるかなど調べたらいいでしょう。どれにも属さないという根拠が示されるなら進展ありですし。 役割についてはしろうと的に考えるに、なにかクルードな多種のバクテリアなどが存在するソースを処理して、フローラが変わるかどうかとかできないかなとふとおもった。 おそらく削れているっぽいのでN末が削れているか、C末が削れているか、両方から削れているのかなどわかれば一つのキャラクタライズができたと言えます。 ＞His抗体を用いたWBは何度か行っていますが、リコンビナントでは上清での確認はとれておらず 大腸菌では分泌システムが働かない可能性はないですか？それともその放線菌で発言させたのかしら？

(無題) 削除/引用 No.7178-10 - 2018/08/28 (火) 17:15:46 - シャペロニン ＞mozさん そうですよね・・・ 初めにお伝え出来なくて申し訳ないです＞＜

(無題) 削除/引用 No.7178-9 - 2018/08/28 (火) 17:05:49 - moz バクテリアか〜。 専門でないとアドバイスは難しいぞ。 https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9209/9209_biomedia_3.pdf

御礼と捕捉 削除/引用 No.7178-8 - 2018/08/28 (火) 16:27:52 - シャペロニン みなさんありがとうございます！こんなに反応いただけると思っていなかったのと、頭が悪いせいで整理・返信に時間がかかってしまい申し訳ないです・・・。 このタイミングでお一人ずつ御礼を打つのはかえって見えずらいと思いますので、まとめてのお礼失礼致します。 扱っている生物種とタンパク質について説明不足で申し訳ございません。勢いで投稿してしまいました・・・。 捕捉させていただくと、生物種はグラム陽性の真正細菌である放線菌です。 タンパク質は、熱ショック応答で誘導されるストレス応答タンパク質で、分泌は培養上清をSDS-PAGEに供し、バンドを同定することで確認しました。また、それは細胞内の大きさとは異なり、約2/3の大きさです。 溶菌による漏れの可能性を排除したいのですが、今のところ早い培養段階での確認(培養3日、Full growthは5日)しか行えていません。培養3日では再現性はとれそうです（現在遂行中）。 大腸菌大量発現株は、マルチコピーベクターを用いて作製済みです。抗体の作製は、お金と時間の問題で私が卒業するまでの時間ではできなそうです・・・。His抗体を用いたWBは何度か行っていますが、リコンビナントでは上清での確認はとれておらず、Hisタグの影響を受けているのでは？という見解に至りました。 みなさんの貴重な意見から出た質問なのですが、、 1. 分泌経路はどのような実験で確認できるのでしょうか？そもそも細胞内での作用しか知られておらず、新奇性の高いタンパク質であるため、分泌経路は全くの未知です。 2. 標的となる細胞はどのようなものが考えられますか？ 3. 同定したタンパク質が確かに細胞外分泌されてることのエンドレベルでの確認はどのようにしたらいいのでしょうか？ どなたかお力いただけますでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.7178-7 - 2018/08/28 (火) 14:56:10 - moz HMGB1なんか核タンパクだけど、炎症メディエーターだったりする。死細胞から放出される。 検出法（抽出法）の詳細がわからないが、エクソソーム内のタンパクが検出されたとか？ 目的のタンパクは、ほんとに分泌タンパクなのか？ 細部外にある＝分泌タンパクとは限らないので注意。 逆にIL1raだったかな、本来分泌タンパクだけど、細胞質でも見つかる（らしい）。細胞質内での機能は不明。

(無題) 削除/引用 No.7178-6 - 2018/08/28 (火) 13:33:36 - asan どういうタンパク質機能を想定してるかによります。 特定の細胞レセプターに反応して何かしらの影響があることを期待するなら機能アッセイを組むところからでしょうが、いずれにせよ仮説トアウトプットがないと何もできませんね。 力技で金かけてそのタンパク質の分泌機能の重要性があるとかんがえるなら、分泌機能のみを潰した（既知機能は影響されない変異体ノックイン細胞またはマウスを作って表現系で異常がないか見る。ピンピンしてるなら特に影響はないだろうとしか言いようがないですね。 ま、学生なら質量分析で同定したタンパク質が確かに細胞外分泌されてることのエンドレベルでの確認（普通のMS解析での同定なら必要）、分泌に重要なドメインの生化学的機能解析、マウス等の個体の入手が可能ならマウス個体での存在の有無の確認（抗体があればベストだが）、あたりの当たり前にできそうな部分をしっかり詰めるだけでもとりあえずBBRCとかそれくらいの論文には十分なるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7178-5 - 2018/08/28 (火) 05:03:42 - おお もう一つヒント 血清

(無題) 削除/引用 No.7178-4 - 2018/08/28 (火) 01:56:16 - おお もっと簡単で重要なところで、たんぱく質のサイズが細胞内のものと比べてどうなのか？糖鎖修飾の可能性など見れるように両者隣りあわせでWBして（その分子量の範囲がしっかり分離される条件で）しっかり考察すると言いかと思います。 ２Dができる環境が整っていればそれもやってみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7178-3 - 2018/08/28 (火) 01:38:40 - おお 私も分泌経路をまずやるのがいいのかなと思いました。既知の分泌経路などから探りをいれて、卒研にはネガティブであっても（否定根拠になるので）しっかり書いておくべきでしょう。いろいろな経路で細胞内のものが外に出ますのでそのへんもきっちり調査するといいでしょう。 あとすぐにやれそうなのは、いろいろな細胞でどの程度分泌されているか、細胞内の発現との相関関係はどうかなど。分泌する細胞のスペクトラムからある程度機能に関して有用な情報になると思います。

(無題) 削除/引用 No.7178-2 - 2018/08/27 (月) 20:05:34 - AP そのタンパク質がどういうものか（その細胞内での機能であるとか、どのカテゴリーに属すタンパク質かとか）、どういう細胞種なのか（培養細胞？　生物組織？）とかヒントがないとなあ。 私なら、まず分泌経路を明らかにする。これは本当に積極的に分泌されているのかどうかをコンファームする意味でも。 あとは、簡単そうなのは標的になりそうな細胞にそのタンパク質をかけて何が起こるか見るとか？　起こるかもしれないし起こらないかもしれない、起こるとしても検出可能かもしれないし困難かもしれない、どういう方法でみるかも問題だね（transcriptomeで発現が動く遺伝子を見つけるとか？　増殖速度など生理的なパラメータを見るとか、、、、）

シグナル配列をもたない分泌タンパク質 削除/引用 No.7178-1 - 2018/08/27 (月) 18:37:58 - シャペロニン 学生です。 分泌タンパク質を質量分析により同定したところ、そのタンパク質は本来細胞内での機能しか知られていないタンパク質でした。 そのタンパク質の細胞外での役割を何か見出したいのですが、実験の進め方、方針がわかりません。。 卒業に向けてどのように実験を進めたらいいのか・・・ 先生も他の学生に手をかけていて、このままでは私は何となく卒業していく気がしてなりません。 どなたかアドバイスいただけませんか。お願いします。

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