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(無題) 削除/引用 No.7171-8 - 2018/08/28 (火) 13:41:45 - asan 浸潤assay：shControlと比較してshRNA1,shRNA3で浸潤亢進, shRNA2で差がなし。 要するにこの結果をどう捉えるかですよ。いずれのノックダウンでも抑制されてるのにフェノタイプが出てないならあなたの見てる現象がそのノックダウンによる効果によるものではないかもしれないし、sh2の細胞がたまたまおかしくなってるかオフターゲットによって影響がマスクされてるかもしれないし、それは考え方と解釈によります。あとは、論文のレフェリーが納得する理由づけとその根拠となるデータをどう示すかにすぎません。 ただ普通に考えて、いずれのノックダウンでもオンターゲットが十分落ちてるのは確かなのに1つでも効果が見られないものがあれば「それはたまたま細胞がそうなってる別の影響をみてるんじゃないの？」と言われるのは至極当たり前のことなので、あなたがそうでないと思うならそういう根拠ある実験を組んで検証するしかないだろうと思います。 ちなみにオフターゲット効果はshRNAの抑制メカニズム上起こりうることだから複数のノックダウンで検証する必要があると一般的に言われるのであって、オフターゲットがあるから嘘だとか嘘じゃないとか、ダメとかダメじゃないとかなんでも白黒つくような性質のものではありませんよ。考え方によっては10回やって1回でも反例があればそれを素直に考えればその効果は違うんじゃないか、としか言えませんが、上で言うような細胞状態がおかしくなったとかなんとでも理由づけはできます。自分ならsh2はもう一回ぐらい細胞を作り直して見るとかやってもいいぐらいですね。

(無題) 削除/引用 No.7171-7 - 2018/08/27 (月) 10:29:40 - 見習い大学院生 おおさま 確かにそうですね。有り難う御座います。他のアプローチで納得のいく結果が得られるか、検討致します。 恐らくレビューアーの疑問も同じ所になると思いますので。 有り難う御座いました。

(無題) 削除/引用 No.7171-6 - 2018/08/26 (日) 20:28:29 - おお お察しのように、実際細胞内で完全に何が起こってそのような結果になったのかは見えないところも多いのでご指摘の可能性は否定できません。 そういう意味では何か違うアプローチをして総合的に判断するしかありません。たとえばKDする代わりに過剰発現（レスキューでなく）して反対のフェのタイプが得られるか？そのKDした遺伝子産物のなるべく直近の下流の遺伝子産物の阻害剤などがKDした細胞で有効かどうかなど（オフターゲットが同じシグナルをその下流遺伝子産物を介していないなら）。実験によってアプローチが違うかもしれませんが、何らかのデーターを取得しある程度納得がいく状況なら、KDの影響という話に持ち込むことができると思います。ｓｈRNAだけの結果では空想の域をでないので。

(無題) 削除/引用 No.7171-5 - 2018/08/26 (日) 13:48:25 - 見習い大学院生 おおさま オフターゲットの認識は、全く一緒です 解釈についても、ほぼ同様に考えております。 しかし、 浸潤assay：shControlと比較してshRNA1,shRNA3で浸潤亢進, shRNA2で差がなし。 の時に、shRNA1がオフターゲットを示しているというよりは、shRNA2のオフターゲットによって、浸潤亢進のphenotypeに影響が出ているということの方が考えられないか、ということです。shRNA3で同様のphenotypeを示しているので。 もちろん可能性の問題ですが。 phenotypeというもの、よく使われる言葉ですが、非常に曖昧なものだと思っています。 assay別に、二つのshRNAで同じようなphenotypeを示せば、これはターゲットのノックダウン効果によるものだと、いうことであれば、上記はやはり有意なものなのか、ということです。 究極的には、各shControl、shRNA1、shRNA2、shRNA3をRNA-seqにかけて、関連遺伝子、オフターゲット（各shRNAでばらついて抑制されている遺伝子）を探索するというのが、理論的だとは思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.7171-4 - 2018/08/25 (土) 12:24:11 - おお オフターゲットっというのは一見ターゲットの遺伝子の抑制で効果がでたと思えるが、実はターゲット以外の遺伝子がshRNAなどによって直接的に変化し、その効果を見ているもの。 したがって一つのshRNAで変化が見られて、他の同じターゲットのshRNAで変化が見られなかった場合最初の前者のshRNAの変化はオフターゲットによるものと判断できるというのが一般的な考え方だと思いますがどうお考えですか。 このことに基づいて 細胞増殖assay：shControlと比較してshRNA1, shRNA2で増殖抑制、shRNA3では差がなし 遊走assay；shRNA1, shRNA2で遊走抑制、shRNA3では差がなし これについてはshRNA3のターゲットの発現抑制が十分でなかったと言えるかもしれません。shRNA1と shRNA2で十分のターゲットの発現抑制がみられその効果があったので、オフターゲットによる増殖抑制や遊走抑制を見ているのではないだろうといえます。 浸潤assay：shControlと比較してshRNA1,shRNA3で浸潤亢進, shRNA2で差がなし。 同程度のターゲット発現抑制効果があるshRNA1と shRNA2でshRNA1だけ効果があるので、shRNA1の浸潤亢進効果はオフターゲットによる効果であって、ターゲットの発現の抑制によるものではない（可能性がある）。 このように解釈するのが普通だと思います。ただ１００％ターゲットの発現の抑制によるものではないと解釈が確実なものかという疑問を挟む余地がまったくないとまでは言いにくいかもしれません。shRNA2で抑制できないスプライシングアイソフォームがある可能性はないですか？

(無題) 削除/引用 No.7171-3 - 2018/08/25 (土) 10:20:57 - 見習い大学院生 おおさま shRNA1, shRNA2はqPCRでは80%以上の抑制、shRNA3は少し悪くて70%程度の抑制です。 細胞表面抗原でもありますので、FACSで抗体の蛍光強度も解析もしていますが、shControlと比較した蛍光強度比は大体同様の結果となります。

(無題) 削除/引用 No.7171-2 - 2018/08/25 (土) 09:41:20 - おお shRNA1, shRNA2、shRNA3でターゲットの抑制効率の違いはありますか？

shRNAのオフターゲット効果について 削除/引用 No.7171-1 - 2018/08/24 (金) 23:06:21 - 見習い大学院生 オフターゲット効果について質問させて下さい。 ある細胞表面接着因子の研究をしており、発現がある細胞株にshRNAでノックダウンを行い、簡単なin vitro、in vivoで解析をしています。 色々な資料にはオフターゲット効果の影響を異なるshRNA（siRNA）で同様のphenotypeを示すことが大事と書かれていて、それはそうだと思っているのですが。 例として 細胞増殖assay：shControlと比較してshRNA1, shRNA2で増殖抑制、shRNA3では差がなし 遊走assay；shRNA1, shRNA2で遊走抑制、shRNA3では差がなし このような場合にはノックダウンした因子が増殖や遊走に関与している。と考えていいと思うのですが。 ここで質問なのですが、 経験的に、実験ごとに異なるオフターゲットエフェクトが確認されるということは時々あることなのでしょうか。 例として 浸潤assay：shControlと比較してshRNA1,shRNA3で浸潤亢進, shRNA2で差がなし。 のようなパターンです。これはふたつのshRNAで同じようなphenotype（表現）が確認されたと考えていいのでしょうか。 レスキューなどの技術を持っておらず、shRNAの数を増やして対応するかしない状況です。 どうぞ宜しくお願い致します。

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