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(無題) 削除/引用 No.7161-14 - 2018/08/23 (木) 10:11:13 - *** グラスミルクで頑張るとか

(無題) 削除/引用 No.7161-13 - 2018/08/23 (木) 09:55:59 - 銅 そもそもプラスミドのサイズはどうなんでしょう？ BACとかだったら下手に容量を増やすより、やや低めにしてシークエンスPCRのサイクルを増やす方がうまくいったような

(無題) 削除/引用 No.7161-12 - 2018/08/22 (水) 18:12:22 - AA たいていのキットではRNaseはP1に入っていると思いますが、 P1にRNaseをいれて、カラムではなく普通にエタ沈してミニプレップすると かなりRNAが残ることがわかります。 (泳動すると100bp未満くらいのところにバンドのようになるくらい) 同じP1-3でも、カラムを通すとほとんどバンドは出ないので おそらくP3以後の状態でのRNAのカラムへの結合能はかなり低いんだと思います。 とにかくシークエンスできればいい、というのであれば、 Midi prepエタ沈後のペレットをTEに溶解後、 PCR purification用のキットに、プロトコル通りに適応するのが一番簡単ですね。 (PCR産物の5倍量のバッファーを加えて〜、みたいなやつです) カラムを使ったサンプルですが、Midiサンプルを再度精製カラムに通すときはそのようにしてます。 経験上、ロスがないとは言いませんが、激減することも無いです。 (100mlLB由来のハイコピープラスミドが、50ulで溶出後に1ug/ul程度の濃度は取れます)

(無題) 削除/引用 No.7161-11 - 2018/08/22 (水) 13:51:12 - AP あ、ひとつよそとやり方が違うかもしれないのは、 私はカラムを使わないで精製するときは最終産物を溶かすTEに10 ug/mL 程度のRNaseを入れていることです（たぶん古典的な方法）。まあ、これでほとんどRNAは見えなくなります。見えないくらいのRNAをも除きたいときはPEG ppt、RNaseはそのままにしておいて構いませんが、あえて除く必要があるとき（IVTの鋳型にするとか）はPCI抽出をします。 だいたいカラムシステムは、おそらく最終産物にRNaseが残るのを嫌がってか、RNase反応が低温のアルカリ変成下あるいは塩析下に置かれていて、ちょっと濃度高めに設定してあるけれど、あんまり効いてない。RNAが十分に分解していれば最初からカラムにバインドすることもDNAの結合に干渉することもないんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.7161-10 - 2018/08/22 (水) 12:55:35 - おお そうですけど１００ｍｌで培養すると２ｍｌほどのミニプレップのRNA量より５０倍も多くなるので、、、ご経験の上ということであればいいのですけど。LiClはカオトロピックな作用があるのでRNA以外も抜けそうだし。

(無題) 削除/引用 No.7161-9 - 2018/08/22 (水) 12:17:52 - AP 通常のミニプレップ用キットではカラムに乗せるライセートにRNaseで断片化したRNAが大量に含まれています。でもカラムを通すと除かれるので、カラムにかける上でそれが問題にはならないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7161-8 - 2018/08/22 (水) 12:12:17 - おお >ほぼRNAなんでしょうか？ 電気泳動するとへたするとプラスミドのバンドの１００倍といってもいいくらいのシグナルがみれますからね。 >その後、ペレットをTEに溶解し、全量をミニプレップ用のスピンカラムで精製する。おわり。 これが一番あれこれ考えずにできてシンプルですね。ただカラムがどの程度夾雑物に許容範囲があるのかちょっと気になります。 カラムに乗せる前にLiClつかってある程度RNA除けばマシになるかもしれない。LiClを加えて最終どうだったっけかな2.5Mぐらいだっけになるようにして３０分ぐらい冷やして遠心すると１００b以上のRNAはたいてい沈殿するので遠心した上清をエタ沈（LiClが塩として働いてくれるので更に塩を加える必要ない）してそれをカラムに。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html えーただTEで溶かして直接のっけてもつかないと思うので、、、わたしならPCR purification用のバッファーを混ぜてからのせるかな。皆さんはこういう場合どのようにのせるでしょうか。おそらくミニプレップ用カラムもミニプレップは乗せる前の操作はP1, P2, P3液でアルコールをいれてカラムに付きやすくしてのせるんだと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.7161-7 - 2018/08/22 (水) 11:54:27 - AP 選択肢としては 1）そのままでもいける（多少、品質が劣るかもしれないけれど、十分実用的。未知配列じゃなくて配列のコンファームならなおさら）。 2）PCI 抽出、アルコール沈殿をする（これでかなり品質は上がるはず。でも一方、除タンパク質が効能だけれど塩析のあとではほとんど中間層はでない）。 3) PEG pptをする（BigDyeのマニュアルでも推奨。断片化したRNAを除くのに有効。一方、サイクルシークエンスではRNAの混入が問題を起こすことはまずない）。 4）精製プラスミドをミニプレップカラムにかける（製品によっては抽出済みプラスミドの再精製プロトコールもついている。そうでなくても自分で組めるよね）。 どれでもworkするはず。あとは up to you

(無題) 削除/引用 No.7161-6 - 2018/08/22 (水) 10:59:59 - 774 P1-3後の上清をミニプレカラムに複数回アプライしたら取れませんかね？ 夾雑物のoverloadでダメなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7161-5 - 2018/08/22 (水) 10:38:12 - ちょこぴー 誤字脱字が多くて自分にびっくりしました...ごめんなさい。 APさんとおおさんの書き込みを総合すると、 ********************************** 100ｍｌの大腸菌カルチャーを遠心しP1-P2-P3でプレップし遠心した上清9ｍｌに、室温のイソプロを9ｍｌ加えて、室温で遠心。上清を捨てた後、70％エタノールを加え再度遠心。そのペレットをまず作製。 その後が曖昧ですが、考えて、書いてみましたのでご覧になってもらえませんか？ そのペレットを300マイクロリットルのTEで溶解。 次に等量の300マイクロリットルのPCI（25：24：1）を加え、激しくボルテックス。 15000ｇ，5分、室温で遠心。 上清を新しいチューブに入れ、等量のイソプロ、1/10量の酢酸ナトリウムを加え、 15000ｇ，5分、4℃で遠心。 上清を捨てた後、70％エタノールを加え再度遠心。 最後にペレットを適当量のTEで溶解。おわり。 ********************************** あるいは、 100ｍｌの大腸菌カルチャーを遠心しP1-P2-P3でプレップし遠心した上清9ｍｌに、室温のイソプロを9ｍｌ加えて、室温で遠心。上清を捨てた後、70％エタノールを加え再度遠心。そのペレットをまず作製。 その後、ペレットをTEに溶解し、全量をミニプレップ用のスピンカラムで精製する。おわり。 ********************************** でしょうか？ 前回、P1-P3後の遠心で得られた上清にイソプロを加えるとガツン！とペレットが出来てしまい怖いです。。 ほぼRNAなんでしょうか？そのRNAをPEG沈殿やらPCIで除去する、ということですよね？ただそれが煩雑だから、APさんはスピンカラムにかけちゃえば、とおっしゃっているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7161-4 - 2018/08/22 (水) 08:43:58 - AP RNA分解物の混入は、それが非特異的プライマーになって、昔のKlenowを使ったサンガー法では問題でしたが、今のサイクルシークエンスでは、アガロース電気泳動でがっつり見えるくらいRNAが残っていても平気です。

(無題) 削除/引用 No.7161-3 - 2018/08/22 (水) 08:36:55 - おお >自作のP1, P2, P3液を使ってライシスのあと、上清々に100エタノールを加えて、エタチンをやろうと思ってますが、前回したところすごい大きなエタチンペレットが出来てしまい、この方法はいけないのかもしれないです。 溶液の組成があっていたらこれで取れているはず。ただし大量のRNAが混じっているのと、これだけではまだそんなにきれいじゃない。エタノールでなくイソプロ等量程度にして冷やさず延伸するといくらか蛋白が共沈してくるのが防げる。RNAはRNaseAを使って消化してしまうのが大抵の方法。LiClを使うと長いRNAは抜けるけどそれでも結構残ると思う。 その他の夾雑物はフェノールクロロフォルムで抜くのが昔からあるプロトコールだけど、PEG沈だけでも配列読むぐらいならいいかも。個人的には尿素６M存在下で３００mM酢酸ナトリウムなどでエタ沈を夾雑物を取るのをたまにするんだけど、どこにもそんなプロトコールは載ってないので。 キットがなかった頃はこのような方法を組み合わせて使っていた。使っていた。

(無題) 削除/引用 No.7161-2 - 2018/08/22 (水) 08:34:51 - AP シークエンス読む程度なら塩析後アルコール沈殿で十分です。私はミニップでも数の多い時なんかよくそうしています。 ローコピーを濃縮すると夾雑物も多くなるので、フェノール抽出やPEG沈殿を加えておくといいかもしれません。あるいはアルコール沈殿後のプラスミドを適当量お持ちのミニプレップカラムにかけても。

ミディキットを使わないで100ml大腸菌からプラスミドをとる方法 削除/引用 No.7161-1 - 2018/08/22 (水) 07:59:24 - ちょこぴー 今コピーナンバーがすごく低いプラスミドを使ってクローニユグをしてます。 ミニプレップ産物のシーケンシングではきちんと波形が読めなかったので、ミディに上げて、いくつかのコロニーのシーケンスを読みたいです。 ただきっとは高いので、どうにか簡便に粗くてもプラスミドをミディカルチャーから取れないかと考えています。 自作のP1, P2, P3液を使ってライシスのあと、上清々に100エタノールを加えて、エタチンをやろうと思ってますが、前回したところすごい大きなエタチンペレットが出来てしまい、この方法はいけないのかもしれないです。 セシウム遠心など、他の方法もあるようですが、そこまできれいでなくてもいいんです。ただシーケンスさえ読むのに十分なプラスミドをとる方法をご存知でしたら教えてください。お願いします。

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