全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.7156-6 - 2018/08/21 (火) 11:23:39 - ume 実験に関しての捕捉です． SA-neurobiotin 488複合体を先に作って、oil-surfactant-biotinに結合させる実験を行ってみました． 複合体はSAとNuerobiotinを先に純水中に入れて攪拌し，４℃で放置する方法で精製しました． 蛍光観察の結果，Nuerobiotin 488が修飾されていることは確認できませんでした． ここで質問なのですが，biotin-streptavidinの結合は短時間で起きるものではないのでしょうか？複合体の精製として４℃で３時間ほど保管していたのですが，考えていた結果と違う結果が出ました． 結果と条件に関して，下記に示します． ここに，mol数は厳密ではないかもしれませんが，それほど大きな誤差ではないと思います． １．SA:Nuerobiotin = 1: 2 (mol数)　　　（４℃で３時間） →　SAの蛍光は確認，Nuerobiotinの蛍光はなし ２．SA:Nuerobiotin = 1: 200 (mol数)　　（４℃で３時間） →　SAの蛍光はうっすらと確認　Nuerobiotinの蛍光はなし ３．SA:Nuerobiotin = 1: 1000 (mol数)　　（４℃で２４時間） →　SAの蛍光・Nuerobiotinの蛍光ともに確認できない 条件２でSAとoil表面の結合が完全になくなると思っていましたが， うっすらと蛍光が確認されました． どなたか反応時間に関して知見がある方がいらっしゃいましたら， アドバイスを頂けると幸いです． また，複合体の精製に関しても注意点等ある場合教えていただきたいです． よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.7156-5 - 2018/08/20 (月) 22:00:30 - ume qq様 貴重なコメントを頂きありがとうございます． SAがoil表面でDSPE-PEG(2000) Biotinと多価で結合するということに関して， SAは立体構造をもつため，全ての反応基が結合することはないと考えていましたが， 確かに検証の必要があると思います． 界面活性剤としてDSPE-PEG(2000)とDSPE-PEG(2000) Biotinを共に利用し， biotin基が少ない状態で実験を行ってみます． また，先に複合体を作ることも試してみたいと思います． 貴重なコメントありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.7156-4 - 2018/08/20 (月) 21:12:48 - qq SA-protein複合体を先に作って、oil-surfactant-biotinに結合させるのは無理なのでしょうか？ oil-surfactant-biotinのbiotin表面密度は高そうなので、そこにSAを結合させると、多価で結合してしまいそうな気がします。 そうすると、細胞接着タンパク質-biotinの結合する余地がないのではないかな？

(無題) 削除/引用 No.7156-3 - 2018/08/20 (月) 20:26:01 - ume moz様 貴重なコメントを頂きありがとうございます． mol数に関してはstreptavidinを加える前に洗浄を行っており， DSPE-PEG-Biotinを充分除去できていると考えていましたが， おっしゃる通り，飽和している可能性は否定できません． この場合，洗浄の回数を増やすことにより，解決できるでしょうか？ また，DSPE-PEGとDSPE-PEG-Biotinを加えて実験する改善策は 行っていませんでした． 実験を行ってみます． 貴重なコメントを頂き本当にありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.7156-2 - 2018/08/20 (月) 19:15:08 - moz streptavidin(SA)が、DSPE-PEG(2000) Biotinで飽和していませんか。 molecule数等を計算して、SAが過剰であることを確認できますか。 DSPE-PEG-BiotinがSAの分子数の4倍以上あると、飽和していると考えられます。 また、100%のDSPE-PEG-Biotin含量でなく、DSPE-PEG＞DSPE-PEG-Biotinとなる様に混合した方が良いと思います（量比は試行錯誤してください）。

biotin-streptavidin-biotin結合がうまくいきません 削除/引用 No.7156-1 - 2018/08/20 (月) 18:28:16 - ume oil dropletを用いた細胞間で利用可能な応力センサの作製を行っています． その際に， １．油滴の表面をbiotin化された界面活性剤で修飾 ２．蛍光ラベル化したstreptavidinを修飾 ３．再びbiotin化された細胞接着タンパク質を修飾 上記の手順で応力センサを作ろうと考えています． ここで，２の蛍光ラベル化されたstreptavidinの結合までは 蛍光観察により確認できるのですが，３のタンパク質結合が確認できません． ３のタンパク質結合の確認方法としては， biotin化された蛍光物質を用い，蛍光観察することで確認しようとしています． ちなみに，それぞれの手順の間に純水 or PBSで３回洗浄を行っています． 界面活性剤としてはDSPE-PEG(2000) Biotin 蛍光streptavidinはthermofisherのもの 最終タンパク質の確認用の試薬としてはneurobiotin 488を利用しています． 温度，反応時間等を変化させてもうまくいきませんでした． 結合がうまくいかない理由がわかる方がいらっしゃいましたら お教えいただけるとたすかります。 よろしくお願い申しあげます

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---