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(無題) 削除/引用 No.7140-17 - 2018/08/15 (水) 22:19:29 - toto > > クロラムフェニコールはタンパク質合成阻害剤です。タンパク質発現量が増えるわけありません。 意外と増える事が報告されていて、大腸菌での大量発現に使われることもあります。Cold shock responseによる効果と考えられています。 Arch Biochem Biophys. 1999 Jul 1;367(1):129-36. やってみたところ、あんまり有効ではありませんでしたが、ものによるのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7140-16 - 2018/08/15 (水) 18:25:31 - AP >それはカラムのキャパシティを超える場合もあり、逆に全く採れなくなる場合もあります。 どこのキットを使ってわかりませんが、おそらくマニュアルにハイコピーの場合とローコピーの場合とで推奨される培養液量が書いてあるはずで、ローコピーのほうがハイコピーより5倍から10倍くらい多くなっているんじゃないかと思います。結局カラムのキャパとはバインディングキャパシティーであり、プラスミドの濃度が低ければ体積を増やすのは道理。

(無題) 削除/引用 No.7140-15 - 2018/08/15 (水) 16:54:46 - cDNA > マイクログラムですが。 すみません、こちらがアホでした。 丁度、普段の操作で5mL培養からハイコピーのプラスミドで150-250ナノグラム/マイクロリットルぐらい、pETベクターで30-70ナノグラム/マイクロリットルぐらいの濃度のものがミニプレップのキットで得られるので、数字が近くて勘違いしました。 私がミニプレップを勧めている理由は、多くのラボでは数mLの培養はいつでも出来るように用意されているけど、100mLだとオートクレーブからなので、面倒だからです。あと、Midiは高いというイメージが強いので。 夾雑物は確かに気になるかもしれませんが、元の濃度が上がれば持ち込む溶液量が減るので、夾雑物も大した量ではないと思っています。それにクローニング用の大腸菌とpETベクターだし、というのも大きいですね。 ほとんど主観ですので、お気になさらないでください。

(無題) 削除/引用 No.7140-14 - 2018/08/15 (水) 12:12:38 - AP >だはは！知りませんでした。お恥ずかしいです。こういうトリックは基本とのことですが、イラストレイティッドなどに書いてあるのでしょうかね。。。すごいなあ。 そういうアンチョコ本（死語）は手順が書いてあるだけで原理的な解説はないか、あっても貧弱か、時には嘘や迷信が含まれています。悪いこと言わないから、先ずMolecular Cloningを引きなさい。

(無題) 削除/引用 No.7140-13 - 2018/08/15 (水) 08:37:09 - プラスミドが採れない APさんありがとうございます！ > クロラムフェニコールはタンパク質合成阻害剤です。タンパク質発現量が増えるわけありません。 そうでしたか。だはは！ > 大腸菌の複製、分裂は新規タンパク質合成に依存します。一方、pBR系oriやその変異体であるpUC系oriの複製はRNA転写に依存するけどタンパク質合成には依存しません。 _φ(･_･ > pBR系プラスミドを有する大腸菌を十分増殖させた後、クロラムフェニコールを加えると、大腸菌は増殖せずにプラスミドだけが増殖するので、一細胞あたりのコピー数を増やすことができます。 なるほど、タンパク質合成を阻害するため増殖はできないけれど、oriはアクティブなのでコピー数は鰻登りなんですね。 > ま、基本ですよ。 だはは！知りませんでした。お恥ずかしいです。こういうトリックは基本とのことですが、イラストレイティッドなどに書いてあるのでしょうかね。。。すごいなあ。 > まあこうしたことしなくても、pUC系の1/10くらいは取れるんですから、それだけ取れれば大抵の目的では十分ですし、培養スケールを10倍すれば追いつくので今や出番は無い。 > 昔は高純度のプラスミドを精製するのにセシウム密度勾配超遠心にかけたり、プラスミドを鋳型とするシークエンスに鋳型量がかなり多く必要だったりして、収率をあげる必要もありましたが。 ＿φ(￣ー￣ ) ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.7140-12 - 2018/08/15 (水) 07:51:13 - AP >クラロムフェニコールで増やせられるんですね。 >タンパク質発現誘導の際にも使うと発現量が増加したりするんでしょうかね。 クロラムフェニコールはタンパク質合成阻害剤です。タンパク質発現量が増えるわけありません。 大腸菌の複製、分裂は新規タンパク質合成に依存します。一方、pBR系oriやその変異体であるpUC系oriの複製はRNA転写に依存するけどタンパク質合成には依存しません。 pBR系プラスミドを有する大腸菌を十分増殖させた後、クロラムフェニコールを加えると、大腸菌は増殖せずにプラスミドだけが増殖するので、一細胞あたりのコピー数を増やすことができます。 ま、基本ですよ。 まあこうしたことしなくても、pUC系の1/10くらいは取れるんですから、それだけ取れれば大抵の目的では十分ですし、培養スケールを10倍すれば追いつくので今や出番は無い。 昔は高純度のプラスミドを精製するのにセシウム密度勾配超遠心にかけたり、プラスミドを鋳型とするシークエンスに鋳型量がかなり多く必要だったりして、収率をあげる必要もありましたが。

(無題) 削除/引用 No.7140-11 - 2018/08/15 (水) 05:06:04 - プラスミドが採れない おおさんありがとうございます！ > Low　CoｐｙだとMiniprepの培養液の容量を５から１０ｍｌにして精製することもありますね。また２YTなどのリッチな培養液も場合によってはつかうこともあるでしょう。ただキットの仕様によってはあまり多くのせられなかったりもするので取り説は隅から隅までよんで確認しておくほうがいいでしょう。 だはは！そう私も理解しております。 100mlと書いてますよん。 > Low copyのばあいクロラムフェにコールを使ったりしてコピー数を増やすというのもあるんだけど、どれ位有効かは疑問視する人もいます。もし質問者が興味があるというならお調べになるといいでしょう。 クラロムフェニコールで増やせられるんですね。 タンパク質発現誘導の際にも使うと発現量が増加したりするんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.7140-10 - 2018/08/15 (水) 05:04:19 - プラスミドが採れない cDNAさんありがとうございます！ >[Re:7] cDNAさんは書きました : > 大腸菌でしか扱う予定がないのにミディプレップは個人的にはお勧めしません。 だはは！ですが、ケースバイケースですよん。 > 得られるプラスミドの濃度が低くて不都合がある時には、ミニプレップの一つのカラムに、2ー5回分ぐらいの溶液を通した方が楽です。 > 回数分だけ純増することはありませんが、pETベクターならハイコピーベクターと同程度の濃度のものが簡単に得られます。 それはカラムのキャパシティを超える場合もあり、逆に全く採れなくなる場合もあります。 ただでさえライゲーションにはごく少量のプラスミドがあればいいのに、現時点で全くワークしないので、プラスミドに何か不純なものが含まれているのではと考えています。そういった理由から5-10mlの菌液をミニプレップカラムにかければ、それはもう不純なものがたくさん入ってきそうで敬遠しました。 > ちなみに、 > >100-150マイクログラム > というのは量ではなくて、マイクログラム/マイクロリットルではないですか？こういうのも、ラボでは通じるとしても、一歩外に出ると正しく表現しないと聞きたいことを教えてもらえないですよ。 マイクログラムですが。

(無題) 削除/引用 No.7140-9 - 2018/08/14 (火) 17:11:14 - おお >[Re:7] cDNAさんは書きました : > 大腸菌でしか扱う予定がないのにミディプレップは個人的にはお勧めしません。 それは収量を考えれば無駄が多いということでしょうか？ > 得られるプラスミドの濃度が低くて不都合がある時には、ミニプレップの一つのカラムに、2ー5回分ぐらいの溶液を通した方が楽です。 Low　CoｐｙだとMiniprepの培養液の容量を５から１０ｍｌにして精製することもありますね。また２YTなどのリッチな培養液も場合によってはつかうこともあるでしょう。ただキットの仕様によってはあまり多くのせられなかったりもするので取り説は隅から隅までよんで確認しておくほうがいいでしょう。 > > ちなみに、 > >100-150マイクログラム > というのは量ではなくて、マイクログラム/マイクロリットルではないですか？ あ、そういえば実際に何ｍｌの培地で培養したのか書いてないな。Midiといっても幅があるし。っとおもったけど１００ｍｌって書いてた。 Low copyのばあいクロラムフェにコールを使ったりしてコピー数を増やすというのもあるんだけど、どれ位有効かは疑問視する人もいます。もし質問者が興味があるというならお調べになるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7140-7 - 2018/08/14 (火) 14:51:46 - cDNA 大腸菌でしか扱う予定がないのにミディプレップは個人的にはお勧めしません。 得られるプラスミドの濃度が低くて不都合がある時には、ミニプレップの一つのカラムに、2ー5回分ぐらいの溶液を通した方が楽です。 回数分だけ純増することはありませんが、pETベクターならハイコピーベクターと同程度の濃度のものが簡単に得られます。 プラスミドの収量については、使われたキットの説明書や、他社のキットでもWebでFAQがいろいろありますので、参考にするといいですよ。 ちなみに、 >100-150マイクログラム というのは量ではなくて、マイクログラム/マイクロリットルではないですか？こういうのも、ラボでは通じるとしても、一歩外に出ると正しく表現しないと聞きたいことを教えてもらえないですよ。

(無題) 削除/引用 No.7140-6 - 2018/08/14 (火) 11:58:42 - プラスミドが採れない APさん だはは！やはりそういう工夫だったんですね！ 勉強になりました！ちびまる子ちゃんの花輪くんを想像しましたw >[Re:5] APさんは書きました : > pETはpBR系のレプリコンでしょう。 > 普通にやったらpUC系のレプリコンの1/10程度ですよ。 > pUC系だと一細胞あたり500~700コピーくらい。pBR系だと30コピーくらいだったかな。 > > 発現ベクターはあえてローコピーにしています。コピー数が多くて外来性のタンパク質が過剰に発現すると大腸菌が死滅したり増殖できなかったりするからです。 > > ま、基本ですよ。

(無題) 削除/引用 No.7140-5 - 2018/08/14 (火) 11:00:39 - AP pETはpBR系のレプリコンでしょう。 普通にやったらpUC系のレプリコンの1/10程度ですよ。 pUC系だと一細胞あたり500~700コピーくらい。pBR系だと30コピーくらいだったかな。 発現ベクターはあえてローコピーにしています。コピー数が多くて外来性のタンパク質が過剰に発現すると大腸菌が死滅したり増殖できなかったりするからです。 ま、基本ですよ。

(無題) 削除/引用 No.7140-4 - 2018/08/14 (火) 06:46:08 - プラスミドが採れない なるほど！おおさんありがとうございます。 勉強になります！まずはクローニングをがんばります！

(無題) 削除/引用 No.7140-3 - 2018/08/14 (火) 06:07:01 - おお >蛋白発現ににはたくさんの要素が影響を受けますので、High copyだからたくさんという風にはならないですが、 プロモーターの強さもありますからね。

(無題) 削除/引用 No.7140-2 - 2018/08/14 (火) 06:03:43 - おお >2ｍｌからミニプレップして、そこにクローニングをしてましたが、全くできませんでした。 全く取れないのはなんか変だと思います。 ＞100ｍｌからミディプレップしたところ、35マイクログラム もうちょっと取れてもいいのかもしれませんが、まあそれくらいかなという感覚はあります。 ＞他のプラスミド（ｐｃDNA3とか）では100-150マイクログラムは採れています コンストラクトによるかもしれませんが、ちょっと少ないかな、、、 ＞このプラスミドで目的のタンパク質を発現させた場合、やはり必然的にタンパク質の発現量や誘導量は低くなるでしょうか？ 蛋白発現ににはたくさんの要素が影響を受けますので、High copyだからたくさんという風にはならないですが、Low Copyでも一見CBB染色でTotalの蛋白の５０％以上を誘導した蛋白で占めるということもある（蛋白などによってこれは大きく違うけど）のでそれ以上の発現系ができるのかという事もあります。またLow Copyでほとんど発現しない場合はいろいろな原因があり（発現したタンパク質が大腸菌の生理状態に影響を与えるとか）、High Copyに載せ替えたからってそれ以上の蛋白が発現するわけでもないかもしれないでしょう。 ＞逆にそれが可溶性分画に発現させるのに適している 発現量が抑えられるような条件で可溶化区分にくる場合もあるので、そういう側面はあるのだと思います。 同時にプラスミド維持にも貢献している場合もあります。インサートが何らかの原因で大腸菌に悪さをするときにLowCopyに抑えてその影響を抑えることができます。その事によってインサートが入ったものをクローニングするとき、途中で理コンビネーションが起きてインサートが脱落して目的のものが取れないとか、発現誘導している途中でインサートが脱落したプラスミドが増えて目的の蛋白の発現が低下するとか言うのを防ぐのにも貢献していると思います。

pET28プラスミドについて 削除/引用 No.7140-1 - 2018/08/14 (火) 04:52:11 - プラスミドが採れない 質問させてください！ pET28プラスミドをアッドジーンから購入しました。 LB固形培地にイノキュレートされた大腸菌をカナマイシンを含む液体培地で増やしました。 2ｍｌからミニプレップして、そこにクローニングをしてましたが、全くできませんでした。 そこでもうミディプレップしたれー！ってことで100ｍｌからミディプレップしたところ、35マイクログラムしか採れませんでした。他のプラスミド（ｐｃDNA3とか）では100-150マイクログラムは採れています。 アッドジーンのページを見るとpET28はローコピープラスミドだと書かれてありました。 これが原因だと思いますが、やはりみなさんもそう思われますか？ もう一つの質問は、 ローコピープラスミドというのは初めて扱いました。 このプラスミドで目的のタンパク質を発現させた場合、やはり必然的にタンパク質の発現量や誘導量は低くなるでしょうか？逆にそれが可溶性分画に発現させるのに適しているとも考えられますでしょうか？ 素人の質問で申し訳ないのですが、よろしくおねがいします！

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