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(無題) 削除/引用 No.7134-14 - 2018/09/21 (金) 19:01:35 - Cas9 薬剤耐性遺伝子入りdonner 1ug / pX330 9ug をエレポして薬剤でセレクションしたら、PCRでノックインされた細胞の存在を確認することができました。ここからシングルセルを拾いますけど、その過程でなくなったら悲しい。

(無題) 削除/引用 No.7134-13 - 2018/08/17 (金) 02:04:57 - coco AA様 丁寧に答えてくださり、ありがとうございます。homology armの長さはcriticalな要因になるようなので、長いarmで再チャレンジしようと思います。 Cas9様 FACSによるEGFP positive cellのセレクション前には、ゲノムPCRで確認はしませんでした。FACSによってEGFP positive cellのシングルコロニー化したものをある程度増やしたところで、目的部位のPCRをし、EGFPが導入されていないことを確認しました。

(無題) 削除/引用 No.7134-12 - 2018/08/16 (木) 20:51:23 - Cas9 おおさんも助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7134-11 - 2018/08/16 (木) 20:49:15 - Cas9 >>asanさん 情報ありがとうございます。高いkitを買ってssDNAを作っていました。 HDRベクターに耐性遺伝子をいれてやってみます。 ついでに293細胞はノックインされやすいですか、されにくいですか？

(無題) 削除/引用 No.7134-10 - 2018/08/16 (木) 18:30:42 - asan >上手くいく人はどうやってるのでしょうか？ なんか簡単そうにやってるようですが。 培養細胞のknock inは効率悪いので、EGFPなんかの大きめのものだと10%もいけばいいところだと思った方がいいです。できればHDRベクターに耐性遺伝子をいれてセレクションマーカー等で濃縮するか、FACSソーティングが必要ですが、細胞によってはHDRの効率が悪いのでdonerみの場合はかなり難しいケースもあるでしょう。論文等でやってるのはssODNのせいぜい100bps程度のものか、ES等のHDR活性が非常に高い細胞であることが多いと思います。世の中で言われてる、lipofectionよりelectropolationを使う、とかNHEJ阻害剤の効果は自分の系では確認できませでした。plasmid donorの代わりにベクターベースでssDNAを作る方法で試した人もいますが、これもいうほど効果的じゃなかったと聞いてます。 ただ、できないわけではありませんが、もう片方(かそれ以外の複数）のゲノムにindelが入ったり、px330由来のCas9のランダムインテグレーションとかもそこそこ起きるので、これを除く必要もあります。 ちなみにMEFの場合は細胞増殖停止するので不死化させて使わないとシングルセル化は難しいんじゃないかと思ったりもしましたが。 EGFPでソーティングする場合は、その細胞がそのタンパク質を恒常的に出してることと、EGFPのknock-inによるタンパク質発現への影響がないことなどが前提になるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7134-9 - 2018/08/16 (木) 12:30:10 - AA ノックインに使われるメカニズムは主にHDRとMMEJで、(HITI法のようなNHEJ-mediatedのものもありますが) 原理ごとに修復が起きる細胞周期が違うので、 細胞によっては特定の原理はつかわれにくい、ということはあるようです。 ただ、MEFの場合どうか、という肝心の情報は持っておりません。。。 50ntだとMMEJになると思うので1kbp以上の長いアームを試してみてはどうでしょう？ 「濃縮」については「選択」と同じ意味で捉えてもらって構いません。 自分がpx458でGFP-FACSをしており、FACS後はGFP陽性細胞の密度が濃くなるため、 普段は「濃縮」という表現を使っていましたが、puroの場合は不適切でした。

(無題) 削除/引用 No.7134-8 - 2018/08/16 (木) 11:52:31 - おお >エレクトロポレーションでpX330 5ugとdonner vector 3, 5, 10ug とふってみました。 >48時間後, 72時間後にゲノムを抽出し、PCRをかけてもGFPが挿入されたは確認できていません。 何らかのセレクションが必要とおもうのだけど、、、相当効率が良ければPCRで引っかかるかもしれないけど結構検出はきつくないかな。

(無題) 削除/引用 No.7134-7 - 2018/08/16 (木) 10:55:21 - Cas9 私もノックインできなくて困っています。 homology armも50bpと500bpで試しています。 pX330 とTvectorにarm-EGFP-arm pX330で目的配列が切れていることはT7 assayや2箇所切断してPCRすることで確認できています。 エレクトロポレーションでpX330 5ugとdonner vector 3, 5, 10ug とふってみました。 48時間後, 72時間後にゲノムを抽出し、PCRをかけてもGFPが挿入されたは確認できていません。 これでできなかったため　市販のKitでinvitro transcriptionしたsgRNAと市販のCas9タンパク質とともにdonnerベクターをトランスフェクションした場合も挿入が見られません。 上手くいく人はどうやってるのでしょうか？ なんか簡単そうにやってるようですが。 >cocoさん セレクション前にPCRでゲノムにGFPが挿入されているのは確認されていますか？ 宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.7134-6 - 2018/08/10 (金) 01:07:45 - coco AA様 お返事ありがとうございます。 armの長さは35ntです。おっしゃる通り、transientな発現を見ていた可能性が一番高いかなと思います。 また、puromycinで処理はしなかったので、今度は処理後のもので試そうと思います。「濃縮」というのは、puromycinで処理後にFACSをかけるという理解で合っているでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7134-5 - 2018/08/09 (木) 13:11:04 - AA armはどのくらいの長さを設定されたのでしょうか？ N末にいれるということで、5'armがプロモーターとして働き、 FACS時点ではtransientな発現を見ていたという可能性は？ 459をおつかいということでしたがpuromycinで選択はかけられましたか？ 大抵の場合、濃縮をかけないとほとんどnegativeになる印象です

(無題) 削除/引用 No.7134-4 - 2018/08/09 (木) 09:17:01 - おお >repair constructのみのトランスフェクションで検証するのと その結果しだいで、GFPポジティブを拾うときの閾値を設定できるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7134-3 - 2018/08/09 (木) 08:49:24 - coco おお　様 お返事ありがとうございます。 確かに、予期せぬプロモーター活性によりrepair constructから直接発現している可能性がありますね。repair constructのみのトランスフェクションで検証するのと、PX459にあるpuro抵抗性のセレクション後にFACSするのを試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.7134-2 - 2018/08/09 (木) 08:32:56 - おお 一つは正常アレルとのホモろガスリコンビネーションでもとに戻ってしまう可能性があると思えますが、そんなに頻度が高いだろうかというきがします。 homology armsを持ったRepair constructの中に予期しないプロモーター活性があって、それによってプラスミドから直接GFPが発現しているものを見ている可能性はあるのかなぁとも。それならば増殖とともに蛍光活性が落ちていくという事を説明できるので。

crispr cas9による導入遺伝子の「抜け」 削除/引用 No.7134-1 - 2018/08/09 (木) 07:29:32 - coco いつも勉強させていただいています。 MEF細胞でCrispr/cas9システムを用いて、目的遺伝子のN末端部位にGFPタグを入れたいと思っています。 GFP配列及びhomology armsを持ったRepair constructと、gRNAを持つPX459v2.0をリポフェクション法で導入したところ、顕微鏡下で数%程の細胞がGFP-positiveとなっていました。 FACSを用いてGFP-positive細胞を選別し、50wellほどシングルコロニーとして増やしたのですが、35mmディッシュまで増やしたところで再度顕微鏡下でGFPシグナルを見てみると、全てのwellでシグナルがなくなっていることがわかりました。ゲノムPCRでもタグが入っていないことがわかりました。 FACSでは、GFPの入ったプラスミドを導入したもの(約20%の細胞がGFP-positiveでした)をポジコンとして設定を行ったので、GFP-positive細胞がきちんと選別できていなかったとは考えにくいです。 1 cellから増やす過程で導入DNAが抜けることはあるのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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