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(無題) 削除/引用 No.7120-6 - 2018/08/05 (日) 04:39:02 - おお ＞その時にはそう聞かれて、2液を混ぜたあと、HRP付き二次抗体をそこへ加えて、液が茶色くなることを確認できたので、 マニュアルには伊かのように書いてますね。 Low HRP activity To test system activity, in a darkroom, prepare 1-2mL of the substrate working solution in a clear test tube. With the lights turned off, add 1µL of undiluted HRP-conjugate to the working solution. The solution should immediately emit a blue light that fades during the next several minutes. これもあまり客観的な評価ができないかもしれませんが、光らなかったり一瞬だけだったりすると使えないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7120-5 - 2018/08/04 (土) 10:48:43 - くぁw２せ３dr４ftgyふじ ECLが原因だとおもうならば、ECLを新しく買い替えればよいのではないでしょうか。いまは、かなり高感度のものもあるし。普通ならexpose1分以内で出るようなものが 30分でようやく弱いシグナルがでてもそれが本物かどうかといわれてたら、？ですし。 実験自体がもっと本質的なところで上手く行っていないか、そもそも4年前のデータが正しかったのかどうかも検討してみることも必要ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7120-4 - 2018/08/04 (土) 09:21:08 - おお ＞CHO細胞へはGFPも他のウェルに導入しておりまして、導入効率は3割ほどです。FCMにて測定しました。 ＞やや低いですが、変異体の細胞なので仕方ないです。 すいません。この文章からどのようにTransfectionしたのかちょっと察しがつきません。「GFPも他のウェル」ということは目的のプラスミドを導入したWellにはGFPは入っていないということでしょうか？ ＞ラボの人も数ヶ月前に、ECLが死んでるかも それは他のラボの人もつかったけどバンドが弱いとかでにくいとか経験しているということですか？それともあなたの結果をみてアドバイスをしているという状況ですか？ ECLがだめになる一番のようそはH2O2が分解などしてなくなってしまうことです。最終濃度が0.01から0.03％になるようにECL　Mixに加えればちゃんと使えることがあります。ただしH2O2自体長期保存ができませんので、大昔買ったものが冷蔵庫にあったからと使ってみたらだめだったということもあるのでそこは慎重にやるべきかと。 隣とか近くのラボからワークしているものを１回分だけ分けてもらえるなら原因解明に役に立つでしょうし、その一回だけでデーターとして使えるならとりあえず一段落するでしょうし。また、ECLキットは各社出しているので出入りの業者に何社かサンプルをもらえるととりあえずはしのげるかもしれません。 myc3タグのプラスミドが何らかの原因で分解してたりとかという可能性はないでしょうか。むかし、前任の人が精製してストックしていたプラスミドを使おうと思って電気泳動したらすめあーなバンドが出たことがありました。たいてい大丈夫なものだという認識でいるのですが、そういうこともあるのかなぁと思ったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.7120-3 - 2018/08/04 (土) 08:23:00 - くぁｗせｄｒｆｔｇｙふじこ すみません会社名書いてましたね。見落としてました。 　 Reviseと言うことで昔と同じ条件が要求されるのかも知れませんが、もし変えてよいのだったら他の会社のものを試しては如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7120-2 - 2018/08/04 (土) 08:21:11 - くぁｗせｄｒｆｔｇｙふじこ ECL(plus?)はどこの会社のものでしょうか？ 某社のモノは数年前から急に発色時間が短くなって蛍光強度も低くなった印象を受けたので他のモノに変えました。それ以来使ってないのでその後改善されたかは分かりませんが。最近は色々な会社からもっと安くて良いものも出てるので、特に困ったことはありません。 最近は、会社の統廃合が多くてそういうのを切っ掛けに品質が低下したり不安定になったりする感じですよね。 某社のコンピタントセルも急に品質が低下したのには参りました。

ECL detection kit 削除/引用 No.7120-1 - 2018/08/04 (土) 05:46:28 - ECL Thermo Fisher ECL detection kitを使ってウエスタンを行なっています。 細胞はCHO細胞。 DNAはpcDNA3.1+ベースのものをPEImaxで導入。 48時間後に1％TritonX100で可溶化、50マイクログラムを8％SDS-PAGEしました。 プラスミドにはmyc3タグをつけており、mycタグに比べ、感度をあげる工夫をしています。 mycだけでも十分ですが、myc3を使っています。 約4年ほど前に行なっていた実験を、リバイスで行う必要があり、再度やっていますが、 4年前まではものの数秒をX線フィルムにエクスポーズすれば強いバンドが出ていましたが、今は30分でうっすらと出ています。非常に再現性も悪く、ある時は全くなんのバンドも出ない時もあります。 非常にストレスが溜まってしまい、混乱しています。 CHO細胞へはGFPも他のウェルに導入しておりまして、導入効率は3割ほどです。FCMにて測定しました。 やや低いですが、変異体の細胞なので仕方ないです。 ただ3割も入って入れば、ガツンとバンドはでるはず...ただ2時抗体を変えたり、1時抗体を変えたりしましたが、あまり改善は見られませんでした。 残るはECLです。 まだ使用期限内ですが、ラボの人も数ヶ月前に、ECLが死んでるかもだのいっていました。 その時にはそう聞かれて、2液を混ぜたあと、HRP付き二次抗体をそこへ加えて、液が茶色くなることを確認できたので、あー、ワークするね。とコメントしてしまいました。ただワークするのが本来の1％なのか100％なのかはそれでは判断できません。 ラボ内に結構人材が行き来するので、ひょっとしたらECLのボトルを誤って扱ってしまった。。なんてことはないかなと心配です。他に原因究明できませんでしょうか？、、、

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