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(無題) 削除/引用 No.7117-14 - 2018/08/21 (火) 09:15:06 - おお http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=7085 こちらでいくらかDiscussionをしています。 あたりが出る確率が低いのはバックグランドが高いことも原因の可能性があるので、そこを工夫すればいきなりミニプレップでもあたりが引ける程度にまで持ち上げれるはずです。

(無題) 削除/引用 No.7117-13 - 2018/08/21 (火) 08:36:22 - さかな >また両末端にベクターとおなじはいれつがあるのだからこの場合でもoverlap extension PCRの産物がでてもおかしくないし。 どうしたら、これを回避することが出来ますか？

(無題) 削除/引用 No.7117-12 - 2018/08/03 (金) 17:59:39 - AP ああ、あり得ますね。

(無題) 削除/引用 No.7117-10 - 2018/08/03 (金) 17:24:33 - AP >また両末端にベクターとおなじはいれつがあるのだからこの場合でもoverlap extension PCRの産物がでてもおかしくないし。 ? これは理屈に合ってるのかしら？

(無題) 削除/引用 No.7117-9 - 2018/08/03 (金) 16:18:34 - おお >ベクターの両側のプライマーでコロニーPCRを行ってみます。 とにかくいまコロニーがあるのだから２０個ぐらいミニプレップしてみたらどうですか？コロニーPCRはワークしているか判断しにくい方法なので、かえってわけが分からなくなってしまうことも多いとおもうので、 F,R両方ベクターの配列をつかって増幅するとなると４ｋｂもあるし難しくなってくる。また両末端にベクターとおなじはいれつがあるのだからこの場合でもoverlap extension PCRの産物がでてもおかしくないし。

(無題) 削除/引用 No.7117-8 - 2018/08/03 (金) 14:33:19 - さかな ＞それだと、つながっていないインサートとベクターから、つながったPCR産物が生じる可能性があると思います。 overlap extension PCRです。 In-Fusionでは末端に15 ntほどの相補配列を置きますが、それがのりしろになってつながった産物ができるでしょう。 overlap extension PCRの可能性は考えていませんでした。 ベクターの両側のプライマーでコロニーPCRを行ってみます。 他の可能性は何か考えられるものはありますか？

(無題) 削除/引用 No.7117-7 - 2018/08/03 (金) 14:25:34 - AP >プライマーは、インサート上とベクター側で増幅できるように設計しています。 それだと、つながっていないインサートとベクターから、つながったPCR産物が生じる可能性があると思います。 overlap extension PCRです。 In-Fusionでは末端に15 ntほどの相補配列を置きますが、それがのりしろになってつながった産物ができるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7117-6 - 2018/08/03 (金) 14:04:29 - さかな プライマーは、インサート上とベクター側で増幅できるように設計しています。 やはり、当たりと思われるコロニー全てからプラスミドが脱落すると考えるのは、現実的ではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.7117-5 - 2018/08/03 (金) 10:04:47 - 774 コロニーダイレクトPCRの弱点はすでに指摘されてるますが、 最初の８コロニーが入ったPCRの陽性率はどうでしょう？ 確率が低くないなら、直接シングルコロニーをPCRするかmini-prepで制限酵素処理で確認するほうが早そうです。

(無題) 削除/引用 No.7117-4 - 2018/08/03 (金) 09:37:35 - AP 最初のコロニーPCRの結果が偽だった。 プライマーはどのように設定していますか？　インサート上ではないですか？ だとすると反応液中に鋳型となるDNAがもともとあるわけで、大腸菌に入っていいようとなかろうと、アセンブルされていようとなかろうと、プレートに塗布されているわけです。コロニーの無いところをつついてもPCRかかるんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.7117-3 - 2018/08/03 (金) 09:35:43 - おお 例えば８個のうち一つが目的のプラスミドを持っていたとして、大腸菌内に複数のコピーがあり、しかもそのような大腸菌が多数でコロニーを持っていた場合、保存中にそのプラスミドが二、三日おいておいただけでぱっと全部PCRがかからないような欠失をおこしてなくなってしまうっていうのが現実的かどうか。

(無題) 削除/引用 No.7117-2 - 2018/08/03 (金) 09:13:44 - おお 組み込まれてないインサートからの増幅を見ていたということはありませんか？

12kbp プラスミド　大腸菌　欠失？ 削除/引用 No.7117-1 - 2018/08/03 (金) 08:38:18 - さかな 8kbpのpMG36cという大腸菌と乳酸菌のシャトルベクターに、4kbpのインサートをinfusion cloning kitを用いて、DH5αにエレクトロポレーションエレクトロポレーション法によって形質転換を行った後、コロニーPCRにより目的のインサートが導入されているか確認しています。10kbp以上のプラスミドを導入する場合、形質転換効率が大幅に低下すると聞いておりましたので、多くのコロニーをつつき、なおかつ試薬を節約したかったため、コロニーPCRに使用する試薬（KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-）を1tube（10µL）あたり、8コロニー分をつついていました。その後、アガロースゲル電気泳動で確認した結果、ポジティブコロニーを得ることができたため、次は、8つのコロニーのうち、どのコロニーがポジティブか確認するために、マスタープレートから1tube（10µL）あたり、１コロニー分をコロニーPCRを行ったところ、どのコロニーからも目的のインサートが導入されているものがありませんでした。 マスタープレートで増殖している間に、プラスミドが抜け落ちてしまっているのでしょうか？

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