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(無題) 削除/引用 No.7116-25 - 2018/08/07 (火) 16:52:42 - おお B6なので同腹の正常マウスなら同じケージにいれてもそんなに問題がないかもしれないけど、変異のため気質が変わっていて一部のマウスにはストレスになっているとかいうものあるかもしれないし。 えさを途中から変えたなら一部のマウスは違和感で食いつきが悪くなるとかないかなぁト思ったりもするけど。 など動物の行動も関係あるかもしれない。 と漠然と思ってもいるのだが、周りに詳しい人いない？ 同時に遺伝的に純化されてない可能性はあるみたいだから、そちらが先かもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.7116-24 - 2018/08/07 (火) 13:00:16 - トピ主です 皆様、様々なご意見・ご指摘をどうもありがとうございました。 23の文字化けは私です。削除キーを設定し忘れてしまって削除できませんでした。すみません。 オフターゲットを考慮して慎重に交配すべきところを不勉強で急ぎ過ぎたため、 このような事態になったのかもしれないと反省しています。 また、確かに食事による代謝は、野生型でもばらつきますし、こちらも慎重に検討しなければいけないですね。 とはいえ、せっかく作ったマウスなので、バッククロスなど、できることからやり直していきたいと思います。 ちなみに、F0のマウス3匹の変異については、すべて同一の変異だという報告を受けています。 このF0同士から交配を初め、F2からホモが生まれてきました。 asan様のご指摘通り、どうやらF0はモザイクだった可能性があり、♀ホモ×♂ヘテロでは、ホモは生まれませんでした。 実験で使ったのは、今のところF2とF3となります。

(無題) 削除/引用 No.7116-23 - 2018/08/06 (月) 22:32:58 - 繝医ヴ荳ｻ縺ｧ縺� 逧�讒倥�∵ｧ倥��縺ｪ縺疲э隕九�ｻ縺疲欠鞫倥ｒ縺ｩ縺�繧ゅ≠繧翫′縺ｨ縺�縺斐＊縺�縺ｾ縺吶�� 遒ｺ縺九↓縺帙▲縺九￥菴懊▲縺溘�槭え繧ｹ縺ｧ縺吶�ｮ縺ｧ縲√ヰ繝�繧ｯ繧ｯ繝ｭ繧ｹ縺ｪ縺ｩ繧りｦ夜�弱↓蜈･繧後�√ｄ繧後ｋ縺薙→繧呈ｨ｡邏｢縺励※縺ｿ縺ｾ縺吶�� 縺｡縺ｪ縺ｿ縺ｫKO繧｢繝ｬ繝ｫ縺ｮ繧ｷ繝ｼ繧ｱ繝ｳ繧ｹ縺ｯ縲∝�ｱ蜻翫↓繧医ｋ縺ｨ3蛹ｹ縺ｮF0縺ｧ蜊倅ｸ�縺ｧ縺励◆縲� F0蜷悟｣ｫ縺ｮ莠､驟阪°繧峨せ繧ｿ繝ｼ繝医＠縺ｾ縺励◆縺後�√�帙Δ縺悟�ｺ譚･縺ｦ縺阪◆縺ｮ縺ｯF2縺九ｉ縺ｧ縲∝ｮ滄ｨ薙�ｯ莉翫�ｮ縺ｨ縺薙ｍ蜈ｨ縺ｦF3縺ｧ陦後＞縺ｾ縺励◆縲�

(無題) 削除/引用 No.7116-22 - 2018/08/06 (月) 12:53:56 - AP >[Re:15] うむむさんは書きました : > 太る太らないという表現型が、単一の遺伝子で綺麗に分けられる、というコンセプト自体が疑わしいが こいつのいけないところは、同じ遺伝子型のKOで表現型が二極化しているのが観察されたのだけれど、原因についてアイデアはないか、というディスカッションをしているのに、ただケチをつけるだけで、なんら建設的なアイデアを出していないこと。流行りの言葉で言えば生産性がない。 単一の遺伝子で綺麗に分けられるという考えに異論を唱えるなら、この現象を説明する他のアイデアを述べるべき。多因子だというならその由来は？　遺伝因子に関わりないというならどういう因子？ そういった考えもなしに、ケチだけつけにくるやつしばく

(無題) 削除/引用 No.7116-21 - 2018/08/06 (月) 12:29:39 - AP 可能性が低そうだってことで、その方向を打ち捨てるようなら、なんのために研究するんだ？　 既知の知見で説明がつく、予想がつくことばかりなら、研究する必要はないじゃないか これ、師がよく言ってた警句

(無題) 削除/引用 No.7116-19 - 2018/08/06 (月) 12:18:12 - AP >[Re:17] AAさんは書きました : > ご指摘のとおりですが、可能性が低い、という意味では、 > ゲノム編集で入るオフターゲット変異が、たまたまhaploinsufficiency、 > またはドミナントネガティブになると言うのもあまり考えにくいですし、 > 複数のオフターゲット＋オンターゲットのKOの組み合わせが原因、 > というのが最も可能性がありそうですが、そうするとできることはほとんどないと思います。 > > マウスが変なのでテーマ中止、という判断がくだされる可能性もあるなら > まずはできることから、という感じではないかと思います。 > あまり考えにくいだの、ほとんどないと思いますだの、まったく説得力がない。 可能性はゼロじゃないだろう。むしろよくある話だと思うが。 その程度でアイデアを否定するなら研究なんてやめちまえ。

(無題) 削除/引用 No.7116-18 - 2018/08/06 (月) 11:27:03 - asan 代謝関係の表現系は、マウスの個体差が結構大きく出やすいのでよっぽど明らかな表現系でない限り 結構慎重に解析することが多いかと思います。また、餌を食う量とか色々なフィードバックもあるので、 逆に近いフェノタイプが出たからといってすぐに変だというのもどうかと思います。 その辺はあくまで、仮説ドリブンでしかないのだから、純粋なサイエンスとしては逆ならそうなる理由を探すしかありません。 同腹マウスで解析して複数の個体で再現できるならオフターゲットの可能性は排除できませんが、 その個体では差があるという解釈でいいのかもしれません。 オフターゲットを除くなら、バッククロスを増やせば連鎖してなければフェノタイプは薄まるでしょうから マウスを作ったならやってみる価値はあるでしょう。CRISPRのオフターゲットの予想はスコアで出せるので、少なくとも予想されるもので影響する可能性がある遺伝子があるか探してみるかなどは可能です。 受精卵crisprはF0ではモザイクになることも結構報告されてますから、そういうマウスを交配に使ってる場合は注意する必要はあるかもしれませんね。ホモだと思ってたら生殖系列でヘテロだったとか。

(無題) 削除/引用 No.7116-17 - 2018/08/06 (月) 10:02:26 - AA ご指摘のとおりですが、可能性が低い、という意味では、 ゲノム編集で入るオフターゲット変異が、たまたまhaploinsufficiency、 またはドミナントネガティブになると言うのもあまり考えにくいですし、 複数のオフターゲット＋オンターゲットのKOの組み合わせが原因、 というのが最も可能性がありそうですが、そうするとできることはほとんどないと思います。 マウスが変なのでテーマ中止、という判断がくだされる可能性もあるなら まずはできることから、という感じではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.7116-16 - 2018/08/05 (日) 19:29:59 - AP 一応coisogenc間の比較ですから、 妥当性はあります。 単一遺伝子の寄与を否定してしまったらobやdbはどうなんだ？

(無題) 削除/引用 No.7116-15 - 2018/08/05 (日) 18:31:58 - うむむ 太る太らないという表現型が、単一の遺伝子で綺麗に分けられる、というコンセプト自体が疑わしいが

(無題) 削除/引用 No.7116-14 - 2018/08/04 (土) 09:01:21 - AA ヘテロ♂2匹とホモ♀1匹で交配している、ということは、 更にその子供同士では交配していないで基本的にはF1世代での解析ということでしょうか？ それぞれのKOアリルを区別すると、 KO-A/WT x KO-B/KO-C または、 KO-D/WT x KO-B/KO-C という交配パターンなので生まれてくる子供の中でKOホモ接合の内容は、 ・KO-A/KO-B ・KO-A/KO-C ・KO-D/KO-B ・KO-D/KO-C の4パターンです。当然ですがどのアリルに着目しても比率は50％です。 実験に使ったマウスも50%が異常な表現型を示すのであれば オフターゲットという説明は納得がいくものと思います。 KO-Aから-Dのどのハプロタイプにおいてもホモになることはありえないので オフターゲットが原因とすればヘテロ変異で異常になるか、 目的の遺伝子のKOとの組み合わせで表現型を示すことになります。 後者の場合は難しいですが、前者の場合は、各オス由来のヘテロ接合の個体を それぞれ区別しながら高脂肪食を与えて、太り方を観察すれば評価できるように思います。 2群間で差が出ればオスのどちらかが、 どちらの群でも半々になればメスが、 それぞれオフターゲットを持つ個体ということになります。

(無題) 削除/引用 No.7116-13 - 2018/08/03 (金) 18:27:51 - GFP 外注との事ですが、KOの確認はタンパクレベルでされてますでしょうか？　以前ここで定型外翻訳という現象の議論があったので、ちょっと気になります。 いずれにせよ、オフターゲットの否定にはバッククロスが必要なのではないでしょうか？　ただし、KO遺伝子に近接したオフターゲット変異はバッククロスしても残るかもしれませんが。 遺伝子型の確認では、KO標的遺伝子に入っている変異は一種類だけ（ヘテロ、ホモに関わらず同一の変異が入っている）なのか、ホモの2アレル及び２種類のヘテロで異なる変異（最大で４種類の変異）が入っているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7116-12 - 2018/08/03 (金) 16:54:23 - どうしたものか・・・ AP様 >ゲノム編集で作成したマウス、予期しない表現型があり、FOインタークロスをしている、となれば、オフターゲットの可能性にあえて目をつむるのはいかがなものかと思います。 おっしゃる通りで返す言葉もありません。個人的にはこの問題を抱えたまま 実験を継続することに抵抗があります。 独り言様 >KOしたのは脂肪に直接関わる遺伝子でしょうか？もし間接的な調節をしているようなものであれば、エピジェネティックな調節とかで、おもしろい説明できそうだと思うなぁ。 直接かどうかははっきりしていないのですが、脂肪に関わる遺伝子です。 オフターゲットの可能性が排除できれば、そのような説明もできるかもしれません。 ざっくり言いますと、KOすることにより、「高脂肪食を食べても太りにくい」というフェノタイプを予測していました。 オフターゲットではなく、代償的なメカニズムの亢進も考えられるかな…。 AA様 太ったものと痩せたものの系統を別に維持すること、試してみたいです。 が、ラボ内で許可が出るか…。 それをやるならテーマの中止の方が、うちのラボの場合可能性が高いです。 また、うちのラボは遺伝子改変マウスの作製に関しては素人なので、F0世代の生産は難しいかと…。 しかし、F0のホモでの評価という方法をご教示いただき勉強になりました。 おお様 >どちらもフェノタイプである可能性を排除できるほど直接的なものってあるようでないと思うけど。 そうですね。上でも書きましたが、KOを代償する効果、かもしれないですし。 >えさはどのように食べさせているんでしょうか？開始時の体重からの増えぐわいはどうでしょうか？ えさは固形のえさを自由摂取です。 開始1週間で、太るのと太らないのが大体わかります。 太るのは同じ週齢（体重も同程度）のB6と同じような感じで増えていきます。

(無題) 削除/引用 No.7116-11 - 2018/08/03 (金) 16:06:11 - おお えさはどのように食べさせているんでしょうか？開始時の体重からの増えぐわいはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7116-10 - 2018/08/03 (金) 16:02:28 - おお >今は、どちらが本当のフェノタイプなのかが分からないと実験結果の解釈ができない状態です。 どちらもフェノタイプである可能性を排除できるほど直接的なものってあるようでないと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.7116-9 - 2018/08/03 (金) 13:10:09 - AA ゲノム編集で作成したマウス、予期しない表現型があり、FOインタークロスをしている、 となれば、オフターゲットの可能性にあえて目をつむるのはいかがなものかと思います。 痩せているもの、太っているものがそれぞれ交配可能であれば。 一度野生型とかけてアウトクロスし、痩せてた系統由来のKOアリルと 太っていた系統由来のKOアリルを独立した継投して捉え、 それぞれのみで再度ホモ接合を取るべきです。 本当に急ぎたいのであれば、F0世代のホモ接合をたくさん用意することをおすすめします。 オフターゲットはある程度ランダムに入るはずなので、F0同士で同じ表現型なら目的遺伝子の表現型と捉えられます。 単純なフレームシフトのKOなら200個くらい受精卵を使えば、 十〜数十匹単位で生まれるはずなので、十分対応可能だと思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.7116-8 - 2018/08/03 (金) 12:32:16 - 独り言 むしろそういった意外なフェノタイプのほうがおもしろい答えがありそうですよね。 KOしたのは脂肪に直接関わる遺伝子でしょうか？もし間接的な調節をしているようなものであれば、エピジェネティックな調節とかで、おもしろい説明できそうだと思うなぁ。

(無題) 削除/引用 No.7116-7 - 2018/08/03 (金) 11:07:01 - AP 遺伝学が絡んだ実験である以上、本筋ではないなんてことは言えないはず。 もちろんバッククロスも考慮しなければ。 だって、そうじゃなければ本当に着目している遺伝子の効果で起こっている現象かどうかわからないってことですよね。そういった検証は、ひょっとすると、残念なことに着目しているKOとは無関係な現象であることを証明してしまうかもしれない。だけどそれを本筋ではないと、最初から目をつぶって、あくまで着目している遺伝子の効果であるとゴリ押しするのがよいのかどうか？ そうしたとしても、論文通らないんじゃないですか？

(無題) 削除/引用 No.7116-6 - 2018/08/03 (金) 10:41:34 - どうしたものか・・・ 皆様ありがとうございます。 AA様 >業者から受け取った最初の世代のマウスは1匹でしょうか？複数でしょうか？ 3匹受け取りました。ヘテロ♂2匹とホモ♀1匹です。 本来はB6とかけあわせるところから交配するのでしょうが、ボスがスピードを 求めていたので、F0世代同士をかけあわせて増やしてきました。 オフターゲットのリスクは承知していたのですが、それを確認するのは （本当にオフターゲットなのか、だとしたらどこに変異が生じたか） 難しいきがします。 AP様 >太っている同士、痩せている同士で継代したら固定化するか、それでも二タイプに分離するか？ それは私も興味がありますが、それをボスに言ったら「本筋ではない」と一蹴されそうです。 今は、どちらが本当のフェノタイプなのかが分からないと実験結果の解釈ができない状態です。 「仕方ないから太ってるのと太ってないのと両方のデータでまとめるしかないよ」、 という意見も出たのですが、それだと結局N.S.になって重要なフェノタイプを見逃すことになりかねないと思いました。 おお様 >性差の可能性は？ 今のところ♂しか実験に供していないので、♀のフェノタイプは不明です。 これまでB6で取ったデータが全て♂なので、できれば♂を使いたいと考えています。 今出ているデータを見ていると、太ったマウスだけ、あるいは太りにくいマウスだけでくくった場合、 ばっちり有意差がつくのですが、それではあまりにも恣意的でサイエンスじゃないなあ、と悩んでいます。

(無題) 削除/引用 No.7116-5 - 2018/08/03 (金) 02:32:33 - おお 性差の可能性は？

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