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(無題) 削除/引用 No.7115-9 - 2018/08/05 (日) 02:06:31 - ピキア おおさん、ありがとうございます。 ＞誘導する前の菌はあらかじめ増やしてストックしたりけいだいしたりして使ってますか？ グリセロールストックを保管しているので、毎回MDプレートに撒いて、シングルコロニーを培養しています。

(無題) 削除/引用 No.7115-8 - 2018/08/05 (日) 02:04:29 - ピキア RGさん、ありがとうございます。 >ピキアのプラスミドは分泌型のものですか？ そうです、分泌型のものになります。 ＞また死菌生菌は何を根拠に言っていますか？ 死んだ菌は軽くなる(?)ので遠心しても沈殿しないということから判別しています。 ＞たまにプラスミドに変異が入って発現しなくなることがある聞いたことがあるので，midiprepからやり直してみるといいかもです． 仰る通り、変異が入ることもあるかと思います。 プラスミドのHIS4領域を介して酵母のゲノムに組み込んでいるのですが、大腸菌等と比べて変異が入る可能性は低いと考えていました。 たくさん考えていただき、ありがとうございます。 カザミノ酸等で分解が抑制されるのは確認済みですが、タンパクというよりも菌自体によくない影響が起こっているように感じます。タンパクが分解しているように見えますが、もしかすると死んだ菌からバーストして出るタンパクなのかもしれません。 あと、発現培地はBMMYで行なっています。マニュアルをいただけると大変参考になります。

(無題) 削除/引用 No.7115-7 - 2018/08/04 (土) 02:40:50 - おお 誘導する前の菌はあらかじめ増やしてストックしたりけいだいしたりして使ってますか？ そういうばあいだと変なクローンが出てきてそれがドミナントになっているというのは（ほかの発現系などでは）よくトラブルになる原因です。 面倒でも毎回直前に線が培養などでシングルクローンを複数拾うか、Transformationからはじめると（ほかの発現系などでは）解決することはよくあります。

(無題) 削除/引用 No.7115-6 - 2018/08/03 (金) 19:15:34 - RG あと、発現誘導はBMGYではなくBMMYなどのメタノール添加培地で行っていますか？ もし必要でしたらメールでこちらのマニュアルをお送りします．

(無題) 削除/引用 No.7115-5 - 2018/08/03 (金) 19:11:24 - RG ピキアのプラスミドは分泌型のものですか？ また死菌生菌は何を根拠に言っていますか？ たまにプラスミドに変異が入って発現しなくなることがある聞いたことがあるので，midiprepからやり直してみるといいかもです． あとは、細菌などがコンタミすると分解や溶菌することが極まれにあるので，コンタミに注意すればよいかと． 私は5年ほどピキアを使って色々なタンパクを作っていますが、酵母エキスペプトンYNBなどの試薬のロットが変わったぐらいでは変な現象は起きたことがありません． また考えられる対策としては、�@器具を入念に洗浄、�A羽無しフラスコ使用、�Bイオン交換水の使用、�C15-25℃での低温培養、�D培養日数ぐらいかなーって感じです。 分解に関しては，0.1-1mM PMSF, EDTA、1%カザミノ酸、スキムミルクの添加で改善した経験があります． 少しでもお役に立てればいいですが、、、

pichia酵母培養における不調 削除/引用 No.7115-4 - 2018/08/03 (金) 16:56:44 - ピキア 現在予想している原因は ・試薬のロット ・試薬もしくは器具からのコンタミ ・BMGYに用いる水（水道水）の質が変化した（？） くらいしか思い浮かびません。 ただし、試験管培養では問題なくタンパク質がSDS-PAGEで確認されていたので、混乱しています。 系が小さいと影響が見られない、もしくは大量培養ではフラスコによる気泡の発生による影響を受けているのでしょうか？ もし、知識がある方がいらっしゃいましたらご回答よろしくお願いします。

pichia酵母培養における不調 削除/引用 No.7115-3 - 2018/08/03 (金) 16:55:02 - ピキア RGさん ご回答ありがとうございます。私が作製しているタンパク質が酵母自体に影響するかどうかにつきましては、必ずしも影響しないとは言い切れないと考えています。ただし、これまで十数回培養して問題は見られていませんでした。また、自分が作製しているタンパク質だけでなく同研究室の他の人のタンパク質でも同じような現象が見られており、タンパク質の種類に関係なく起こっているものと考えられます。

(無題) 削除/引用 No.7115-2 - 2018/08/03 (金) 15:53:54 - RG 自分も同じような現象が起こったことがあります． もしかして発現タンパク質はプロテアーゼなどの酵母自身にダメージがありそうなタンパク質ですか？ その他詳細な培養条件があればアドバイスしやすいのですが、、、 自分の場合はとある糖質関連酵素でしたが，培養条件や試薬を変更しても改善されなかったので，酵母の形質転換からやり直しました．

pichia酵母培養における不調 削除/引用 No.7115-1 - 2018/08/02 (木) 17:31:24 - ピキア メタノール資化性ピキア酵母を用いて変異タンパク質を作製しているのですが、最近突然タンパク質が作製できなくなりました。状況としてはメタノールによるタンパク質誘導期後に酵母が死んでいたり、死なないにしてもタンパク質がかなり分解を受けたりしています。 培養条件や試薬は変えていないため、試薬のロットを疑っているのですが、同じような状況の方がいらっしゃいましたら教えてください。宜しくお願いします。

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