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(無題) 削除/引用 No.7112-9 - 2018/08/04 (土) 02:56:01 - おお もし手持ちの２次抗体や検出試薬の劣化も懸念だったら隣のラボとかにいって１回分だけ使わせてもらえばどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7112-8 - 2018/08/04 (土) 02:18:47 - GFP ５倍、２５倍、１２５倍と希釈して流し、二次抗体を１：20,000まで下げて見ましたが、何ら変わりない結果に終わりました（希釈なしの融合タンパクだけ、きれいに検出されました）。GFPが検出できない理由は白抜け以外にある可能性を考えたいと思います。 とりあえず、導入効率が293Tほど高くない線維芽細胞でトランスフェクションして、同じ実験をやってみることにします。こんな基本的なところでつまづいているのが、ちょっと情けないです。

(無題) 削除/引用 No.7112-7 - 2018/08/03 (金) 01:33:28 - qwdfsb 暑い中ウェスタン乙。発現してモノがそこにあることも確かで、抗体もgoodなのにシグナルが無いということなら、みんなが言うようにOverloadingで白抜けしたんだとおもう。抗体の感度が高いこともあるかもしれないけど、いまの検出系や発現量に応じたサンプルのアプライ量がただしく設定されていないのが一番大きいとおもう。そういうときうちらがよくやるのは電気泳動サンプルを段階的に希釈するとかして今のアプライ量の1/500量, 1/200, 1/100, 1/50, 1/10, みたいにして並べてウェスタンして、いい感じのシグナルが得られるアプライ量をみつけてから、その条件で本番のWBをする。内在性の蛋白質とかだと1~10μg/wellくらいでいい感じのシグナルえられることが多いので条件検討しなくて適当にやっても１回でうまくいくことも多いけど、強制発現とか基本的に発現量がしばしば、ふだんの細胞内ではあり得ないようなレベルなのでやっぱそういうときは遠回りにみえても検討したほうがいい。後から見ればそのほうが時間と労力を無駄にしなくて済むから。

(無題) 削除/引用 No.7112-6 - 2018/08/01 (水) 11:59:36 - おお >再度どうもありがとうございます。仮にケミルミ試薬がへたっていた場合、高発現のEGFPでは白抜けが急速に進んで検出不能になる一方、低発現のEGFP融合タンパクでは白抜けが進まないためシグナルとしては逆転する、 使う試薬が、保存用ボトルの中でへたってなくても過剰なシグナルがあれば同じ傾向があるだろうと思います。 ＞仮に酵素（HRP）がへたる事により「枯渇」したように見えると考えた場合、二次抗体の減量は逆効果と考えられますでしょうか？ 実際に酵素のへたりが原因なのかきしつの枯渇なのかは調べて結論が出たわけではないので（きしつの枯渇と（根拠はしめしてないけど）書かれた説明が多いかと思いますが）、これについて仮にという話自体あまり役に立たないとおもいます。試薬自体がちゃんとワークすることが前提で、わたしなら２次抗体の量は下げます（経験的にはそれでうまくいくので）。一次抗体は抗体の能力しだいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7112-5 - 2018/08/01 (水) 08:51:26 - GFP おおさん、再度どうもありがとうございます。仮にケミルミ試薬がへたっていた場合、高発現のEGFPでは白抜けが急速に進んで検出不能になる一方、低発現のEGFP融合タンパクでは白抜けが進まないためシグナルとしては逆転する、という現象が起き得るという理解で良いでしょうか？　 また、仮に酵素（HRP）がへたる事により「枯渇」したように見えると考えた場合、二次抗体の減量は逆効果と考えられますでしょうか？　本日ライセートの量を振って（５倍及び２５倍希釈）ウエスタンを流してますが、明日の二次抗体の量をどうするか、今回は1:5000のままにして変数を減らした方が良いような気がしてきました。 SuperSignal West Picoの場合、室温保存可となっているperoxideベースの試薬（「stable peroxide」と記載されていますが、 hydrogen peroxideかは不明です）をルミノールと混ぜて反応します。これまでは大きな問題がなかったので冷蔵してませんでしたが、シグナルの持ちが短くなっている印象と合わせると、冷蔵しておいた方が無難かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.7112-4 - 2018/08/01 (水) 05:05:50 - おお その商品は使ったことはないですが、今までの経験上ケミルミの試薬がへたってきたなと思えるときは、強いシグナルの減衰が著しく早くなってきます。１０秒でシグナルが出て、もうちょっとシグナルがほしいと思って３０秒ほどExposureしたのに、かえってシグナルが弱くなったり、見えなくなったり。 商品によっては０．０１から０．０３％ぐらいのH2O2の添加でへたりを解消できるものもあります。 あと基質の枯渇と書きましたが、そのように見えるということで実際に何が起こっているか詳細の分析を見たわけではありません。H2O2などが枯渇するのか、反応が早く酵素のほうがへたるのかなどいろいろな可能性があると思いますけど。 最近はH2O2の代替えで比較的安定なものを使ったのが出回っているようで、そういうのは保存できる期間が１年だとか、室温保存可能だとか言うものもあります。H2O2ベースのものは冷蔵で２ヶ月ぐらい保存可能とか比較的Shelf lifeが短いです（と感覚的に思ってます。というのも商品に組成が完全に明記されてない場合がほとんどだと思うので）。

(無題) 削除/引用 No.7112-3 - 2018/07/31 (火) 11:48:49 - GFP おおさん、どうもありがとうございます。HRP-conjugateの二次抗体（GE/Amershamの抗ウサギIgG抗体で、通常は1:5000で使ってます）なので、基質の局所的枯渇の可能性を考慮し、Lysateの量を振ってみようと思います。抗体濃度については、二次抗体から下げてみようと考えていますが、ご意見ありますでしょうか？ あと、ケミルミの検出試薬はSuperSignal West Picoを昔から使っていますが、最近シグナルの持ちが悪く（短く）なった気がしており、局所的枯渇との関連が気になります。検出試薬の感度の良し悪しやシグナル持続時間と、基質の局所的枯渇の間には、どのような関係性があると予測されますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7112-2 - 2018/07/31 (火) 05:17:45 - おお HRPだとシグナルが強すぎると検出を始める前に基質が局所的に枯渇してしまいうまく検出できないことがあるのですが（場合によってはバンドの中が抜けて輪郭だけになるとか）、そういう場合はLysatesの量を５分の１ぐらいにしてみるとか、１、２次抗体の濃度を低くして検出感度を調整してみるとか。

GFPのウエスタン 削除/引用 No.7112-1 - 2018/07/31 (火) 04:17:19 - GFP pEGFP-C1あるいは２種類の異なるEGFP融合タンパクを、PEIでHEK293Tに一過性発現させ、界面活性剤ベースの溶解バッファーに溶かして、GFPのウエスタンをやっています。一次抗体はアブカムのウサギポリクローナル（ab6556）を用いています。 遺伝子導入効率は、タンパク抽出前にFACSで確認し、pEGFP-C1ではほぼ100%でした。タンパク溶解液もdenatureするまでは肉眼でも黄色に光っているのが確認され、十分なEGFPを含んでいると考えられたのですが、ウエスタンでは全くバンドが見られませんでした。 一緒に流した２種類のEGFP融合タンパクは、低めの導入効率（30-70%）で、肉眼で溶解液が光って見えるようなことはありませんでしたが、ウエスタンではどちらも予測されたサイズで検出されました。よって、抗体反応そのものは上手く行っていると考えられます。 融合タンパクでは検出されて、EGFPのみだと検出できない理由が分からず、困っています。メンブレンをCBBで染めてみると、pEGFP-C1のサンプルでは、30kDaあたりに少し強いバンドが見られますが、それ以外は他のサンプルと変わりなく、タンパク凝集や転写ミスなどは示唆されません。 EGFPの高発現により何らかの問題が起きている可能性とか、あり得ますでしょうか？　 ご意見伺えると助かります。

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