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(無題) 削除/引用 No.7104-12 - 2018/08/07 (火) 12:37:10 - cris asan さん ありがとうございます。大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.7104-11 - 2018/08/06 (月) 11:38:56 - asan px330かpx458等でprimerを注文してハイブリダイズしてそのままbbsIで切った配列にligationすれば一番簡単です。bbsI切断サイトは相補的でないので、脱リン酸化処理等しなくてもそのまま普通に入ります。 受精卵やhard to transfect系の細胞でやる場合はCas9 prtein+ sgRNAまたは Cas9 prtein + crRNA+ tracrRNA等を入れる方法がとられることもあります。この方がvectorベースでやるよりもはるかに効率が良い場合が多いです。sgRNA等は最近はIDTあたりで一本2万程度で買えるので、正直よっぽど節約したいわけでもなければ合成で注文してしまった方が低コストです。Cas9淡白も一度買えば保存が効きますしね。

(無題) 削除/引用 No.7104-10 - 2018/07/28 (土) 13:58:01 - cris うん 様 ご返信ありがとうございます。 やはり、1番は一番コストもかからなくて楽でいいですよね。 私も最近、AddgeneよりPX459を入手致しました。V2.0とはそういうことだったんですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7104-9 - 2018/07/28 (土) 11:10:24 - うん 1です。 Addgeneの　Addgene: pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 を使っています。 プロトコールは 実験医学別冊　最強のステップUPシリーズ　今すぐ始めるゲノム編集 の、変法golden gate反応を、そのまま使いました。 余談ですが、上記ベクターで Ver.2.0となっているのは、初期のものはピューロマイシン耐性遺伝子の活性が弱いためです。

(無題) 削除/引用 No.7104-8 - 2018/07/27 (金) 11:33:03 - cris カートン箱 様 なるほど、その手があったかと思いました。大変参考になりました。ありがとうございます。 価格も2本鎖合成に比べて安く、早く届くので至れり尽くせりですね。 Rv鎖をgRNA scaffoldの配列にしておいて、Fw鎖をT7 promoter -target seqにしておくんですね。 Rv鎖をいつも同じにできるアイディアも素晴らしいです。

(無題) 削除/引用 No.7104-7 - 2018/07/27 (金) 11:05:08 - カートン箱 >IVTでgRNAを合成されているとのことですが、T7 promoterを含めてすべて２本鎖で合成されてますか？ 一本鎖のFw鎖とRv鎖（各約70mer, オーバーラップ約30mer）をそれぞれ発注しています。 Fw, Rv鎖を混合してPCRで二本鎖にし、これをシリカメンブレンカラムで精製して、T7のIVTキットで転写という流れ。 この方法は、Fw鎖のターゲット配列を変えるだけでsgRNAが作り分けできるのが長所です。 短所は、二本鎖化・精製をする分手間が増えることですね。

(無題) 削除/引用 No.7104-6 - 2018/07/27 (金) 10:12:52 - cris あ 様 詳細な情報をありがとうございます。やはり、ssDNAを合成 -> アニールが楽でいいですよね。 ただ、遺伝子組換え申請書をコンストラクトごとにたくさん出すのは面倒くさいなと思っておりまして、2 or 3の方法で探っていこうかなと思っておりました。 大変参考になりました。 カートン箱 様 お返事ありがとうございます。 IVTでgRNAを合成されているとのことですが、T7 promoterを含めてすべて２本鎖で合成されてますか？

(無題) 削除/引用 No.7104-5 - 2018/07/27 (金) 09:30:05 - カートン箱 Cas9の方も、ベクターで発現させるのか、精製タンパクを細胞内に直接導入するかの選択肢がありますね。 sgRNA共々、以下の条件も判断材料になってくるでしょう。 ・使う生物種がプラスミドを保持できる種類かどうか ・ゲノム内に発現コンストラクトを組み込む場合、ゲノムにCas9やsgRNAの配列が導入・維持されることを許容するか否か ちなみに私は３のパターンでsgRNAを作っています。 ゲノム上に余計な情報を載せたくないのと、ターゲット遺伝子の数が多いので自分でRNA合成した方が安上がりになることが理由ですね。

(無題) 削除/引用 No.7104-4 - 2018/07/27 (金) 00:39:50 - あ それぞれssオリゴを注文して、それをアニールさせるだけです。10分で終わることです。 2、3についてですが、 ガイドによっては編集が全くできないものも多々あります。 なので私は最初にいくつか（2-3）ガイドを作り、その中からもっとも編集効率の良いものを選びます。 2.　3は手間がかかる上コストがかかります。手間をかけてコストをかけて作ったはいいが、編集効率がゼロの場合だってあります。なので私は1を選びます。 もちろん、論文で使われているガイドを流用するのであればそれでいいのかもしれませんが、2、3を選ぶメリットを私は感じません。

(無題) 削除/引用 No.7104-3 - 2018/07/26 (木) 20:33:53 - cris あ 様 ご返信ありがとうございます。 クローニングするDNAは二本鎖DNA合成してますか？

(無題) 削除/引用 No.7104-2 - 2018/07/26 (木) 19:22:00 - あ 1です。手間というほどのものはないです。

CRISPR/Cas gRNAどうやってます？ 削除/引用 No.7104-1 - 2018/07/26 (木) 19:00:49 - cris みなさまがどうやっているのかお聞かせください。 Crispr/casの実験ではgRNAを作ることになると思うんですが、皆さんはどうされてますか？ 様々な方法があるかと思いますが 1. Cas発現ベクターとgRNA発現が一緒になっている。 2. gRNAは合成している。 3. DNAを合成してin vitro transcriptionで自作。 1.はクローニングの手間がかかってしまうのが難点かと思いますが、かなり安上がり？ 2.は時間はかかりませんが、お高めかと思います。 3.はIVTが手間ですね。 これ以外にも手法はあるかと思いますが、今はどれが主流なんですかね？ よろしくお願い致します。

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