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(無題) 削除/引用 No.7091-17 - 2018/07/24 (火) 14:05:00 - PCR たくさんの書き込みをありがとうございました。 ようやくPCRがかかりました。 みなさまのおかげです。ありがとうございました。 AP様の方法でうまくいきました。

(無題) 削除/引用 No.7091-16 - 2018/07/23 (月) 15:29:14 - AP >ただPCRがかかりませんでした。 このときの反応液を少量取り、完成形の両末端のプライマーでPCRかけたら出来てくるんじゃない

(無題) 削除/引用 No.7091-15 - 2018/07/21 (土) 19:04:06 - AP ちなみにoePCRは3 pieces でもできます。

(無題) 削除/引用 No.7091-14 - 2018/07/21 (土) 19:01:41 - AP 最近の変性温度が98℃になっているのはアーキア由来の酵素がしゅりゅうになっているからでしょう。 古典的なTaqの活性半減期は、95℃では40分あるのに対し、100℃では5分未満です。 古細菌由来だと、100℃の半減期はは資料が見つかりませんが、95℃で数時間あります。ですからより高い温度でも十分に活性が保たれるんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7091-13 - 2018/07/21 (土) 18:47:09 - AP スレッドの流れはよく読んでいませんが、 付加したい長い配列をもつプライマーでPCRというのは、見方を変えれば、overlap extension PCR (oePCR)とやろうとしていることは同じ。oePCRでは二本の長い鋳型DNAを、末端の短い相補配列で結合させた産物を増幅します。この二本の鋳型のうち一方をやや長い合成DNAにしただけですね。 ですから、脳内実験で条件がああかもしれないこうかもしれないと心配するより、完成形のDNAの両末端に対するふつうのプライマーも加えてふつうにPCRかけたらいいんじゃないかな。 overlap extension PCRをよく知らないなら、検索したら一発で出て来ます。

(無題) 削除/引用 No.7091-12 - 2018/07/21 (土) 17:33:13 - v おおさん >最近は変性過程は98℃,10 sec たしかにここは本質的な部分から外れてましたね。すいません。 昔のthermal cyclerは性能が今よりも劣っていて98℃はきつくて95℃,20 secを推奨していたので、今の性能の良いthermal cyclerでは98℃,10 secがベターというイメージを持ってました。 普段使っているtakara ex taqは98℃推奨ですね。98℃がきついtaqもあるんですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7091-11 - 2018/07/21 (土) 17:06:41 - おお >最近は変性過程は98℃,10 sec 最近とか流行があるのかはよく分かりませんけど、Taqでこの条件は厳しいのではないかな。使っている酵素しだいかもしれませんよ。１００ｂｐ以上あるPCRプロダクトをプライマーにしても（メガプライマー法などという）通常の変性条件でできるので温度は私はあまり気にならないです。時間は伸ばしてもいいのかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.7091-10 - 2018/07/21 (土) 15:52:29 - v >これほどまでにプライマーが長いと、95℃で変性する時間は20秒では足りないでしょうか？ なぜ変性温度を95℃にしているのですか？古いthermal cyclerをご使用ですか？最近は変性過程は98℃,10 secが一般的かと思います。関係ないかもしれませんが。 私は、signalを入れたり、site-direct mutationをよく行いますが原因はprimerが長いことではないと思います。 >Taqを使いましたが、バンドは出ずでした。 このような実験にTaqを使われているので、このような実験にはあまり馴染みが無いのでしょうか？ 一番効果的なのは酵素を変えることかと思います。各社、高成功率のPCR酵素を販売しています。まず、これらを試してみてはいかがでしょうか？いろんなメーカーのPCR酵素を使い比べてみると意外と出なかったバンドが出たりします。今回の場合、おすすめはKOD plue neoかGflex tksです。 >5‘- gggc+GCGGCCGC (Not1) 本題からはそれますが、Not Iの場合、付加配列は4 bpだと少し切断効率が悪いのでもう少しつけたほうがよいのでは？ 成功を祈っております。

(無題) 削除/引用 No.7091-9 - 2018/07/21 (土) 10:08:29 - おお >95℃20秒/50℃5分の２ステップ これぐらいアニーリング温度が低いと、伸長反応は７２度にしたほうが良くないですか？

(無題) 削除/引用 No.7091-8 - 2018/07/21 (土) 09:22:22 - moz ＞これほどまでにプライマーが長いと、95℃で変性する時間は20秒では足りないでしょうか？ 液量によります。200uLPCRチューブで、50uL液量なら十分です。 10uLなら１秒でも問題ないです。PCR条件を複数試す（当たりを付ける）場合は、5-10uL液量で変成・アニール各1秒で行っています。 さて、折角の長いPrimerでどうするかですが、plasmid (cDNA)が鋳型だとして (1)95℃20秒/50℃5分の２ステップPCR 15サイクル>95℃20秒/72℃1分の２ステップPCR 10~15サイクル (2)95℃20秒/45℃1秒-(0.1℃/sで上昇）-72℃1分　20サイクル (3)95℃20秒/72℃10分の２ステップPCR 30サイクル はいかかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.7091-7 - 2018/07/21 (土) 07:36:31 - おお >やはりおお様はこのPCRプライマーペアではPCRは無理でしょう、という印象でしょうか？ なんとも言えません。PCRフラグメントをプライマーにして更に長いPCRフラグメントを増幅するような方法もありますので、できないこともないのかなと。 >Nestedで徐々に末端を追加...これはつまりクローニングを何度も繰り返すということですよね。やはり急がば回れということでしょうか。 クローニングは必要ありません。５０b以下のプライマーで半分ぐらいをTagの配列にして、PCRして、そのPCR産物を更に末端に追加の配列をもつプライマーで増幅するというものです。

(無題) 削除/引用 No.7091-6 - 2018/07/21 (土) 06:17:46 - moz 私なら、長鎖Oligoは高価なので短めのOligoを６本合成して、3つのパート（5'付加配列+@, cDNA+@, 3'付加配列+@)に分けてPCR＞それらをPCRで連結します。 5'付加配列+@および3'付加配列+@は鋳型なしでPCRします。 連結させるための重複配列は、それぞれ15-20bpにしています。

(無題) 削除/引用 No.7091-5 - 2018/07/21 (土) 05:00:33 - PCR おお様、ありがとうございます＞＜。 やはりおお様はこのPCRプライマーペアではPCRは無理でしょう、という印象でしょうか？ ２ステップ...初めて聞きました。どういった効果が期待できるのか、調べてみます！ Nestedで徐々に末端を追加...これはつまりクローニングを何度も繰り返すということですよね。やはり急がば回れということでしょうか。 全長合成は...時間との兼ね合いで厳しいかもしれません。95塩基のプライマーオーダーだけで2週間かかりました＠アメリカ中部 through IDT.

(無題) 削除/引用 No.7091-4 - 2018/07/21 (土) 03:37:55 - おお さいしょの４サイクルぐらいはお示しの条件で、そのあと 95℃、20秒 68-72℃、1分 の２ステップでやるとか。 Nestedで徐々に末端を追加していくとか。 最近は全長合成も依頼できたりするよね。

(無題) 削除/引用 No.7091-3 - 2018/07/21 (土) 02:19:55 - PCR み様、ありがとうございます。 少しというかだいぶ自分の書き方が悪かったです。すみません。 私の目的は大腸菌のタンパク質XYZを、ヒト一型膜貫通タンパク質AのN末側に付加させたいんです。 これをpcDNA3.1+で作りたいです。 そこで、まず、 1.　pcDNA3.1+に、"Kozak seq + IL-2 signal sequence + XYZ（XYZはGFPと同サイズです。）"をまずクローニング 2.　1ができれば、XYZの直後に内在性のシグナル配列を除去したヒト一型膜貫通タンパク質Aを融合させたいです。 >[Re:2] みさんは書きました : > 根本的な質問ですが、手持ちの全長cDNAにはシグナルペプチドが既に含まれていませんか？ ヒト一型膜貫通タンパク質Aには内在性のシグナル配列が含まれて居ますが、今回はそれを除いた上で融合させたいんです。 > Forwardもreverseもtailに長い非特異的配列を持っているからPCRかかりにくそうですね。 やはりそうですか...ストラテジーとして間違っているのでしょうか。。 > すんなり行かないなら御自身が言及されているような順番に入れていく方法をとるかなあ。 > しかし、僕ならそんな長いタグではなく9ペプチドくらいのタグを使用するとか、既にベクターにタグが入っているものを優先的に使用する。 やはりそれが一番手っ取り早いですよね...ただXYZのN末にシグナル配列を持つプラスミドはアドジーンでも売られていないので、やはり自分で作らねばと考えています...

(無題) 削除/引用 No.7091-2 - 2018/07/21 (土) 02:02:52 - み 根本的な質問ですが、手持ちの全長cDNAにはシグナルペプチドが既に含まれていませんか？ Forwardもreverseもtailに長い非特異的配列を持っているからPCRかかりにくそうですね。 すんなり行かないなら御自身が言及されているような順番に入れていく方法をとるかなあ。 しかし、僕ならそんな長いタグではなく9ペプチドくらいのタグを使用するとか、既にベクターにタグが入っているものを優先的に使用する。

シグナル配列を付加する方法について。 削除/引用 No.7091-1 - 2018/07/21 (土) 01:31:47 - PCR 大変初歩的な質問かと思いますが、不安があるので、質問させてください。 私は今、1型膜貫通タンパク質のN末にシグナル配列を、C末にV５タグを挿入したいです。 このタンパク質のcDNA全長はありますので、これを鋳型にPCRでシグナル配列とタグを付加したいです。 フォワードプライマーとして、 5‘- gcgc+GGATCC (BamH1)+GCCACC(Kozak)+signal sequence (60 bases)+complementary sequence to cDNA (20 bases) -3' というように、約95塩基あります。 リバースプライマーとして、 5‘- gggc+GCGGCCGC (Not1)+V5(52 bases)+complementary sequence to cDNA (20 bases) -3' ただPCRがかかりませんでした。 期待されるPCR産物のサイズは800塩基ほどです。 Pfu Ultra IIやTaqを使いましたが、バンドは出ずでした。 95℃、2分 ************* 95℃、20秒 50℃、20秒 72℃、1分 ************* 72℃、10分 12℃ これほどまでにプライマーが長いと、95℃で変性する時間は20秒では足りないでしょうか？ 50や60といった相補的な配列が鋳型にない塩基を付加したい場合、この方法は第一選択として間違っているでしょうか？ この方法では間違いで、 例えば、MCSにシグナル配列をまずクローニングする（プライマーペアをそのままアニールさせて直接クローニングする）のを先に行い、その後、目的の遺伝子をV５タグ付きでクローニングするなど1つずつ行うべきでしょうか？ このようなPCRは実は初めてで、うまくいくか正直自信がありませんでした。 これほど長いと20秒の変性では完全に一本鎖にならず、PCRがかからないのではと考えています...。 ご助言いただけますと幸いです。

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