トピ主です。
結果はインサートなしのものと変わらず、インサートを加えても大腸菌コロニーは出てきませんでした。
プラスミドはaddgeneから購入した、pET His6 MBP TEV LIC cloning vector (1M) (Plasmid #29656)です。（www.addgene.org/29656/）
このサイトには以下のようにクローニングの手順が書かれてあります。
**************
This plasmid is an empty vector to be used with a LIC cloning protocol.
It has a TEV-cleavable His6 fusion tag on its N-terminus. MBP can enhance your protein's solubility and expression. It can also be used as an affinity tag.
To clone into this vector, add LIC fusion tags to the 5' end of your PCR primers.
Forward - 5'TACTTCCAATCCAATGCA3'
Reverse - 5'TTATCCACTTCCAATGTTATTA3'
Linearize the plasmid with SspI and gel purify.
When digesting the DNA with T4 polymerase, use dCTP for insert and dGTP for vector.
**************
これに倣い、
まずプライマーを注文しました。5’側に指示されたアダプターが付いています。
これを用い、PCRを行い、ゲルから精製、その後、NEBバッファー2.1とｄCTP、T4DNAポリメラーゼを加え、20ulの系で30分室温、その後、75℃30分処理しました。
一方、ベクターの方はミニプレップ産物をSsp1で1時間消化し（この時、未消化のものも用意して、きちんと切断が起きているかと確認しています。）、ゲルから精製、その後、NEBバッファー2.1とｄGTP、T4DNAポリメラーゼを加え、20ulの系で30分室温、その後、75℃20分処理しました。
ベクターを1ul、PCR産物を4ul（コントロールとして水4ulも用意）を30分、室温で反応後、DH5alphaは形質転換させました。結果はどちらもコロニーゼロでした。
同時に他のプラスミドのクローニングもしていましたが、そちらではコロニーは生えています。
LICに用いるすべての試薬は新しいです。
プライマー配列も注文し直し、正しいです。
実はLICで75℃20分処理した後、DNAリガーゼを加えたものも作製しましたが、そちらでもコロニーはでませんでした。
Ssp1はブラントでカットする制限酵素です。脱リン酸化処理もしていないのにセルフライゲーションコロニーが出ないということは、T4DNAポリメラーゼによる3’-5’exoヌクレアーゼ活性はあるのだと思いますが、、、。
ｄCTPやｄGTPがワークしていないのでしょうか...
それとも75℃、20分の処理ではT4DNAポリメラーゼの失活は不十分でしょうか？
一応、addgeneにはこのプロトコルが載っています。
www.addgene.org/protocols/lic/
あまりに時間がかかってしまい、自分に嫌悪感すら感じ始めました。。
LICは難しいのでしょうか？
改善すべき点がありましたら、どうかご指摘いただけませんでしょうか？
どうかよろしくお願いいたします。 |
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