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(無題) 削除/引用 No.7082-6 - 2018/07/17 (火) 08:11:12 - OK みな様、ありがとうございます。 ＞DNase処理をしない場合にはRT-PCRは問題なくかかるんですよね？ これもコントロールとして検討したかったのですが、サンプル数が多くなるし、まずはシンプル実験としてこれはしませんでした。 ＞加熱処理時間を厳密に守らないとRNAが壊れると注意書きがあったりしますが、逆にいうとそれを守ってもそれなりに分解は進んでいるはず。 やはりそういう理解だったのですね...質問して良かったです。 トリゾールでの再度抽出をすることにします。 みな様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7082-5 - 2018/07/16 (月) 14:29:06 - AP その手のキットは、下流の実験に持ち込むEDTAを極力減らすために随分と低濃度に日和ったEDTAを使っている印象があります。経験上、加熱処理されたRNAは全くの無傷ではないです(泳動像などで見て)。加熱処理時間を厳密に守らないとRNAが壊れると注意書きがあったりしますが、逆にいうとそれを守ってもそれなりに分解は進んでいるはず。 私はDNase処理後、フェノール抽出に代えて、もう一ラウンドTrizolします。

(無題) 削除/引用 No.7082-4 - 2018/07/16 (月) 11:22:24 - おお わたしも、そのような処理だけでまったくかからなくなってしまうのは不思議に思います。

(無題) 削除/引用 No.7082-3 - 2018/07/16 (月) 11:19:20 - TK-1 > キットの方法で今回行いましたが、RTーPCRがかからないので、ひょっとしたらEDTAが不完全でRNAが分解されてしまったのかと考えています...。ご助言いただけますと幸いです。 DNase処理をしない場合にはRT-PCRは問題なくかかるんですよね？

(無題) 削除/引用 No.7082-2 - 2018/07/16 (月) 07:24:23 - おお トリゾールで再抽出 いまちょっと確認できないけどアルコールで変性できるならエタチンでもいいかと

RNA抽出の際のDNAse処理後の処理について 削除/引用 No.7082-1 - 2018/07/16 (月) 01:46:15 - OK 現在、DNAを除く目的でRNAをトリゾールで抽出した後にシグマのDNAse kitを用いてRNAseを処理しています。 その後のDNAse除去や失活方法について相談させてください。 DNAseが70℃、10分で失活することは知っています。またこの時、EDTAを加熱前に加えておかないと、金属介在性に非酵素学的に分解されてしまうことも知っています。 質問は、EDTAさえ加えておけば、100％非酵素学的RNA分解は抑えられるのか、それともDNAse処理後に加熱なんてせず、スピンカラムでDNAseを除去した方が安全でしょうか？ スピンカラムは私の研究室にはなく、できればDNAseキット付属のEDTAと加熱だけでDNAseを失活できたらよいのですが。。。 キットの方法で今回行いましたが、RTーPCRがかからないので、ひょっとしたらEDTAが不完全でRNAが分解されてしまったのかと考えています...。ご助言いただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

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