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(無題) 削除/引用 No.7073-37 - 2018/08/11 (土) 10:29:07 - おお >やはり、もう一度エクソントラップベクターに戻り、 >Kpn-intron-Exon26-intron-Kpn 手段を複数持つことは結果への近道と言えると思います。

(無題) 削除/引用 No.7073-36 - 2018/08/11 (土) 09:46:49 - おお RT- でバンドが出ているのでDNase処理が十分でないでしょう。とくにプラスミドはTransfectionで細胞にはいるコピー数を考えるとしっかりとした処理が必要です。なので今の段階で評価が少し難しいとおもいます。 5.　RT+、WT　minigene　　　　851と、640くらいに強い2つのバンズ とくにこのPCRでEndoが増幅されるはずなのに見れないわけだから残存プラスミドとcDNAの間でCompetitionがかかっていると言えるでしょう。 たとえばEx２５と２６のイントロンだけスプライシングが起きないmRNAやEx26と２７の間のイントロンだけスプライシングが起きない産物がおおかれ少なかれ見れる場合があります。サイズからしてそのどれかであるということをまずは考えてみてください。そういうバンドが見れていてもWtとMutで考えられているスプライシングパターンの割合が変わるならひとまずMutの性質を言うことができると思います。

(無題) 削除/引用 No.7073-35 - 2018/08/10 (金) 07:01:16 - mini-gene おおさん、 アップデートさせてください。 ただいまグラント執筆中で26エクソンのみのコンストラクトはまだ作っていませんが、RT-PCRをする際のプライマーを新しくデザインしてみました。 そのrationaleとしては、これまでのRT-PCR用プライマーはプラスミドやゲノムなどの配列から増幅できるけれど、ｃDNAとなると増幅できなくなる、そういったプライマーである可能性がありました。それはおお先生からご指摘していただいたことです。 今回新しくプライマーを作成したので、増幅されうるバンドサイズは以下の通りです。 unspliced：851， WT　spliced：386， Patient　spliced：エクソン26スキップなら、386より短くなるはず。 以下が結果です。 1.　RT-、EGFP　　　　　　　　　バンドなし 2.　RT-、WT　minigene　　　　851に強いシングルバンド 3.　RT-、Patient　mini-gene　　851に強いシングルバンド 4.　RT+、EGFP　　　　　　　　　386に強いシングルバンド 5.　RT+、WT　minigene　　　　851と、640くらいに強い2つのバンズ 6.　RT+、Patient　mini-gene　　バンドなし 7.　トランスフェクトしたプラスミドそのものをPCR鋳型に用いたポジコン　851に強いシングルバンド 8.　水をPCR鋳型に用いたポジコン　バンドなし でした。漸くminigeneアッセイっぽくなってきました。 ただまだいくつか疑問があります。 1.　RTの前にDNase処理しているのにもかかわらず、2と3でバンドが出てしまう謎。 この解釈としては、DNaseで切断されなかったゲノムやプラスミドが残存している可能性、もしくはスプライシングを受ける前のpreｍRNAを見ている可能性。後者であればやむを得ないですよね？ 2.　4で内在性と思われるバンドが認められました！ので、これまで使っていたPCRプライマーはおおさんのご指摘のように、ゲノムやプラスミドを鋳型とした場合に増幅できるけれど、ｃDNAとなると増幅できないという代物のようです。 3.　本来であれば5でも386にシングルバンドを認めるはずでしたが、ほんのりとしか認められずこれが内在性のものなのか、ｍｉｎｉｇｅｎｅ由来のものなのか不明です。。もっとよくわからないのは640くらいにバンドが出てしまったことです... 結果の解釈に困惑しています。 やはり、もう一度エクソントラップベクターに戻り、 Kpn-intron-Exon26-intron-Kpn ． で行うべきなんでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.7073-34 - 2018/08/07 (火) 07:14:32 - mini-gene おお先生、 ありがとうございます。 やってみます。感謝しております。

(無題) 削除/引用 No.7073-33 - 2018/08/07 (火) 06:39:00 - おお >もう一度エクソントラップベクターに戻り、Kpn-intron-Exon26-intron-Kpn >をクローニングしてみようと思っています。。だめでしょうか pCDNA３の系が働いているかどうかわからないということなので、以前議論した点を注意した上でやってみるのは一つの選択肢でしょう。

(無題) 削除/引用 No.7073-32 - 2018/08/07 (火) 03:31:21 - mini-gene おお先生、 引き続きコメントをお寄せくださりありがとうございます。 ストレイトフォワードな実験だと思い、引き受けましたが、私自身の浅はかさも大きいですが、これほどまでにうまくいかないものかと失意の日々です。 ゲノム断片は正常人と患者からのものです。 導入している細胞はCOS-7細胞です。 プライマーが認識するDNA配列はいずれも100％保存されています。 COS7で目的の遺伝子がそもそも発現しているかはわかりませんが、確かに内因性の遺伝子は発現が認められないのはおかしいかもしれませんね... 一度、他のプライマーも合成してテストすることにします。 CHX処理や遺伝子特異的プライマーも試してみます。 あと... もう一度エクソントラップベクターに戻り、 Kpn-intron-Exon26-intron-Kpn をクローニングしてみようと思っています。。だめでしょうか...シンプルにしてみてはどうかと期待していますが、時間ばかりかかり私自身の実験が進まない状況です。原因はもちろん私にあるのですが、非常に情けないです。。

(無題) 削除/引用 No.7073-31 - 2018/08/07 (火) 02:34:21 - おお 結果がでないということで、残念です。一つ考えるべきことはEndoの転写産物が検出されていないことです。単純に発現してないのでしょうか？発現している細胞ではそのプライマーセットで検出されているのでしょうか？説明がうまくできませんが、DNA（プラスミド）で増幅可能であっても、同じ配列のRNAからのcDNAでは増幅が難しかったりするプライマーセットも経験上あるにはあります。 cDNAはすでにあるので可能な他のプライマーセットはありませんか？また場合によってはRNaseHが有効な場合があります。たしかそのプラスミドには転写開始位置の下流にT7、PolyAサイト上流にSP6の配列があり（逆だったかもしれないけど）そういうのがラボにあれば使えると思います。ただしT7、SP6のプロモーター配列はプラスミドによって微妙に違うこともあるので配列の確認は必要かと思います。 pCDNA３からこのように発現させて発現が確認されなかった事はなかったので、解決方法として具体的に示せることはあまりないですが、、、CHXしょり、スペシフィックプライマーをOligodtプライマーに混合してcDNAを作るなどやってみてもいいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.7073-30 - 2018/08/05 (日) 15:17:01 - mini-gene おお先生、 返信が大変遅れて申し訳ありません。 先ほど全ての実験が終了しましたので、報告させてください。 >pCMV上にフォワード 転写開始位置より下流であることを確認していますか？ 浅はかでした。転写開始点よりも上流にFwd primerがあったので、これではダメですね。。 RNA抽出後にDNA処理する前後でサンプルを一部取り、2 ugを1% agarose電気泳動してみました。 すると28Sと18SのrRNAが非常に強く認められました。分解は一見起きていないと思われます。 DNAse処理後、再度Trizolで RNA抽出を行い、正確に5ugをRTしました。dTプライマーを使っています。 その後、mini-geneをクローニングに使用したFwdとRevのプライマーを流用し、RT-PCRを行いました。 RT-PCRのポジコンは、トランスフェクトしたプラスミドそのものを使いました。 予想されるサイズは、ポジコンはun-splicedの1.4 kbのはず。一方cDNA from WTでは650 bp、cDNA from mutantではおそらくexon 26 skipのため500 bpくらいが見えると考えていました。 結果は、ポジコンでは1.4 kbのバンドを認めましたが、cDNAの方ではどんなバンドも認めませんでした。。 非常に困惑しております。GFPを一緒に発現しておりまして、フローサイトメトリーにて5割が発現していることは確認しています。 一方、HPRTや18S、beta actin はRT(+)の方でバンドが出ており、RTはしっかり行ってるはずです。 以上のことから、プラスミドは細胞に導入されているけれど、mini-gene由来のものが発現していないか、急速に分解されていると考えています・・・。 Exon Trapではなく、今回はpcDNA3.1+を用いています。 midiprep産物をtransfectしており、綺麗にプラスミドは精製できています。 DNA配列のシークエンサーで確認しているので大丈夫です。 pcDNA3.1+にクローニングしたのは、 Kpn1-exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1です。 kozak配列も開始メチオニンもご提案いただいたように付加していません。 cycloheximideは使っても今回は無意味でしょうか？ 一体なぜ発現しないのか、途方に暮れています。 dTプライマーではなく遺伝子特異的なプライマーでRTすべきでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7073-29 - 2018/08/01 (水) 07:53:16 - おお >図7.1を見てみました。すると、通常の1％アガロース/TAE bufferでの電気泳動のようですね。 >これでRNAの電気泳動ができるんですね...。確か修士の頃はホルムアミドを加えたり、バッファーも特殊なものを使っていたと思います。 変性条件で（ホルムアミド、ホルムアルデヒドをつかう）やるほうが個々のバンドがシャープではっきりした泳動になるでしょうけど。通常のDNAでやるような電気泳動でもRibosomal RNAのIntensityを見るには十分です。泳動前にLoading Buffer（DNAでつかうようなものでもいいし、ウレアまたはホルムアミドが入ったものでもいい）を加えた際に７０度程度に加熱して、急冷ごすぐに泳動するようにすれば通常のDNAでつかうアガロース電気泳動でも変性状態で流れます。ただし徐々に構造的変化をしてきますので、あまり長い間電気泳動をせずに１０から１５分ぐらいで検出してしまうぐらいにすると良いです。 プラスミド精製などでRNaseを使うことがある（方法によるでしょうけど）ので、泳動そうなど一度よく洗って（H2O2などでRNaseを失活させるか、SDS溶液を注いでよく洗うなど）、おくといいでしょう。Loading bufferは新たにおろしたものを使うとかすればより良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.7073-28 - 2018/08/01 (水) 07:37:05 - おお >pCMV上にフォワード 転写開始位置より下流であることを確認していますか？

(無題) 削除/引用 No.7073-27 - 2018/08/01 (水) 06:35:36 - mini-gene おお先生、 なんどもお助けいただきありがとうございます＞＜。 RNAの電気泳動は修士の時にRT-PCRを始めたばかりの時にインテグリティのチェックのために行った以来です。 図7.1を見てみました。すると、通常の1％アガロース/TAE bufferでの電気泳動のようですね。 これでRNAの電気泳動ができるんですね...。確か修士の頃はホルムアミドを加えたり、バッファーも特殊なものを使っていたと思います。 変性しなくても18S、28Sをチェックするくらいは一般的な1％アガロース/TAE bufferでも可能ということでしょうか。知りませんでした。 はい、実はベクターバックボーンのpCMV上にフォワードを、ベクターバックボーンの下流にリバースプライマーを設計し、それでもPCRをしているのですが、かかりませんでした。 RNAが分解しているという可能性は一番しっくりしますね。ハウスキーピングのかかりすら悪いので... ありがとうございます。ぜひ、きれいな環境で1％アガロース/TAE bufferで抽出し終えたばかりのRNAを泳動してみます。

(無題) 削除/引用 No.7073-26 - 2018/08/01 (水) 04:47:28 - おお >https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/sample-purification-and-quality-assessment.html ちょっと騙されたと思ってでもいいですから、上のFig7.１のようにRT直前のサンプルの一部を電気泳動してみてください。 また、プライマーがRTPCRに不向きな可能性も考えて、pCDNAの上流のT7とスペシフィックなプライマーで増幅するのも加えてやって見ではどうでしょうか。

アップデート 削除/引用 No.7073-25 - 2018/07/31 (火) 09:34:42 - mini-gene アップデートさせてください。 共同研究者らが作製したExonTrap plasmidからKpn1で切り出される、以下配列をpcDNA3.1+にそのまま移し変えました。 Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1 DNAシークエンスは確認しており、間違いありません。 この”ミニプレップ”プラスミドをCOS-7にPEImax法で導入しまして、48時間後、トリゾールでRNAを抽出、その後、DNAse処理を行い、再度トリゾールでRNAを抽出しました。 その半量（具体的なRNAは測りませんでした...たぶん極端に多いと思います。基準の10倍量くらいは使っているかも...）をdTプライマーでアニール後、RTを行いました。 結果、RT-に比べ、RT+の方でハウスキーピング遺伝子の発現を認めました。 ただ、問題のミニジーン由来のPCRは全くかからず、ポジコンとしてプラスミドそのものはただしくバンドが出ます。 以上のことから、ミニジーンを挿入したプラスミドに由来するmRNAが作られていないか、少ないことを示唆していると思います。ハウスキーピングHPRT遺伝子のバンドも40サイクルにしては飽和しておらず、フェイントなバンドを示しているので、RTがうまくいっていない可能性もあると思います。 次回、RNAを4ugきちんと測りとってRTを行うことにします。 それで問題が解決するかどうかはわかりませんが...。

(無題) 削除/引用 No.7073-24 - 2018/07/24 (火) 06:01:05 - mini-gene おお様、 重ね重ね、感謝しております。本当に感謝してもしきれないです。 共同研究者らはなぜシングルエクソンのみではなく3つのエクソンをつなげたのか、その真意はわかりませんが、私もそこに疑問は持ちませんでした。おお様のご指摘のように複雑にしているだけの可能性もあるのですね。このトピックを立てさせていただいて、あまりに自分の無知に打ちひしがれています。 答えばかりを先走って求めてしまい、不快な思いをさせてしまっていたら本当に申し訳ありません。 > >エクソンに開始メチオニンとKozak配列が必要 > 必要ないです。蛋白レベルの解析ではありませんので。 そうだったんですか...とても恥ずかしいです。 これから大至急Kpn1で処理することにします！！！！本当にありがとうございます！！！！ > お示しのプラスミドは一つのエクソンとその上流と下流をいれて、エクソンが取り込まれる状況にあるかを確認するために開発されたものだと思います。とくにIntronは長いものも多いのでKpn1- exonA-intron-exonB-intron-exonC-Kpn1をPCRして発現ベクターに入れるのが難しい場合もあるのでそれだったら周りのエクソン（A,C）をアーティフィシャルにしようという発想のように見えます。 大変勉強になりました。 おお様、心から感謝しております。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7073-23 - 2018/07/24 (火) 04:38:08 - おお >エクソンに開始メチオニンとKozak配列が必要 必要ないです。蛋白レベルの解析ではありませんので。 >ペアとなるスプライスサイトを含むイントロンと、エクソンをクローニングしなくてはいけないのではないのでしょうか？ 間違えといってはいないんだけど、、、お考えの構成ではExon２５やExon２７の挙動も見れる構造になっているのでアーティファクトでE25やE27が取り込まれなかったりしたりとかしたばあいどう解釈するのかという事です。構成が複雑になればなるほど予想外のことが起こる可能性も増えるわけだし。もしE25とE26のイントロンの塩基置換がE25の取り込みに関与する可能性も考えているなら悪くはないでしょうけど、それでも私はアーティフィシャルなハイブリッドMinigeneにする必要はないかもしれないと思っています。 いまあるKpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1を切り出して発現ベクターに入れてLigationしTransformationすれば翌日にはクローンが取れてその翌日ミニプレップし酵素処理で入っているのも、方向を確かめればその日のうちにTransfectionでき、さらに翌日か翌々日にはRTPCRで結論が出てしまう。 E25上流やE27下流の配列を含めるプライマーを設計してPCRして入れるだけかもしれませんが、PCRの条件でスタックすれば時間をロスするし、ベクターに入れても配列を確認しないといけないし。結局１週間かかってもおかしくない。 そもそもスプライシングを調べるのはお示しの製品が出る前からやられていて歴史があり、その間ゲノムのフラグメントを発現ベクターに入れて調べられてきたんです。 お示しのプラスミドは一つのエクソンとその上流と下流をいれて、エクソンが取り込まれる状況にあるかを確認するために開発されたものだと思います。とくにIntronは長いものも多いのでKpn1- exonA-intron-exonB-intron-exonC-Kpn1をPCRして発現ベクターに入れるのが難しい場合もあるのでそれだったら周りのエクソン（A,C）をアーティフィシャルにしようという発想のように見えます。

(無題) 削除/引用 No.7073-22 - 2018/07/23 (月) 22:15:55 - mini-gene >[Re:21] おおさんは書きました : > https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5992166/ > ようするのこのようにしたほうがシンプルで、このやり方だとExon25と２７の代わりにベクターのエクソンが使われているのが従来の使い方のようです。 > おなじ発想でベクターのエクソンの代わりにExon25と２７を使ってもいいわけなので、 私が勘違いをしていないのであれば、私のプラスミドも、MCSの5', 3'それぞれにエクソンがあります。そしてそのエクソンとMCSの間に一方だけのスプライスサイトがあります。 こういったデザインである以上、ペアとなるスプライスサイトを含むイントロンと、エクソンをクローニングしなくてはいけないのではないのでしょうか？前の投稿で私の書き込みがわかりにくいのか、直接的な答えを聞かせてはいただけませんか？間違っている、もしくはそれで良いかを。。もちろんお示しいただいた論文のように、エクソン一つと、その両端に変異を含むイントロンを入れるのはシンプルでいいですよね。それも並行してやってみます。ただその前に私は折角なので学びたいんです。このプラスミドのデザインがこれである以上、クローニングには両端にスブライスサイトを含む(150bpほどの)イントロンが必要かどうか、ただそれだけなんです。その考えが正しいか否かをまずクリアしていきたいです。 > Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1 > を普通の発現ベクターにいれればそれで十分ということです。実際にこのようにゲノムのフラグメントを発現ベクターに入れるだけどスプライシングの解析をしている文献は結構あり ありがとうございます。 知りませんでした。。pcDNA3.1にゲノムのエレメントをクローニングすると、きちんとイントロンが認識され、スプライスされるんですか。。cDNA用といいますか、イントロンの配列までアミノ酸に変換されると思っていました。。。それならエクソントラップベクターは必要ないですね。。しかし、エクソンに開始メチオニンとKozak配列が必要と思うのでクローニングはしなおさねばいけませんね。

(無題) 削除/引用 No.7073-21 - 2018/07/23 (月) 16:30:07 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5992166/ ようするのこのようにしたほうがシンプルで、このやり方だとExon25と２７の代わりにベクターのエクソンが使われているのが従来の使い方のようです。 おなじ発想でベクターのエクソンの代わりにExon25と２７を使ってもいいわけなので、 Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1 を普通の発現ベクターにいれればそれで十分ということです。実際にこのようにゲノムのフラグメントを発現ベクターに入れるだけどスプライシングの解析をしている文献は結構あります。 http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1006039 HRAS minigenes Genomic DNA was used for PCR amplification of a fragment of the human HRAS gene (NC_000011.9) encompassing exons 1–4 using Platinium Pfx DNA Polymerase ... The amplified fragment was digested with NheI and XhoI and cloned into the polylinker of pcDNA.3.1+ (Invitrogen). Mutations were introduced by site-directed mutagenesis using standard methods either by the authors or by GeneScript Inc. (GenScript, Piscataway, NJ, USA). All plasmids were sequenced by GATC Biotech AG (Germany) in order to exclude any PCR derived errors. そういうことでハイブリットわざわざこれからする手間も必要ないですし、Vector exon-intron- exon25-intron-exon26-intron-exon27-intron-Vector exon-PolyAのような複雑な構成にしていろいろアーティファクトがきになるものにわざわざする必要もないと思います。 トラップベクターがスプライシングの解析に使われないといったのは、むかしトランスジェニックマウスでGene trapようのトラップベクターをイメージしていました。

(無題) 削除/引用 No.7073-20 - 2018/07/23 (月) 13:30:46 - mini-gene おお様、重ねてお礼申し上げます。 遺伝子の変異はエクソン25とエクソン26の間のイントロンに存在します。 具体的にはエクソン26の5’上流のイントロン内のスプライスアクセプターサイトが一塩基置換を起こしており、その部位でのスプライシングが起きないのではと考えています。つまり、 MCSには野生型の場合、 Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1がクローニングされており、 一方、変異体の場合、 Kpn1- exon25-intron-*-exon26-intron-exon27-Kpn1 (* denotes mutation) です。 なので、このコンストラクトのままでは、野生型の場合のスプライシングはおそらく、エクソン25を含む転写産物はできない、ということまでは予想しています。そうなってはだめなのですが...。 私が期待している結果は、野生型ではエクソン25~エクソン26-エクソン27の転写産物ができるのに対し、変異体の方ではエクソン26のスキップが起きるのではないかと期待しています。 > 実際はそれよりもベクターにあるスプライシングサイトが邪魔していると言えるでしょう。Exon２５の３’スプライシングサイトが弱いと上流のIntron部位を加えても同じようなことが起こる可能性があります。真ん中のExon26の挙動を調べたければ、 おお先生の言われるスプライシングサイトというのがアクセプターのことなのかドナーのことなのかわかりませんので、正しく理解しているかはわかりませんが、このベクターはミニジーンアッセイ用として市販されています。ベクターの元々のデザインがこれである以上、それに合わせてクローニング産物をデザインしなくてはならない、というのが私の考えです。 共同研究者らがMCSにクローニングしたのはエクソン3つとその間にあるイントロン2つです。おお様が言われるようにエクソン25の5’側のスプライスアクセプターサイトはそもそもクローニング産物には含まれていないことが私のシークエンス結果から明らかになりました。 そういった理解から、私がこのベクターのデザインに対してクローニングしなくてはならないのは、再度の繰り返しになりますが、 Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1ではなく、 Kpn1 - 150 bp intron - Exon25 - intron - Exon26 - intron - Exon 27 - 150 bp intron - Kpn1これでなくてはならない、というのが私の今現時点での理解なんです。間違っているのでしょうか？ > なのでKpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1をpCDNA３．１などの発現ベクターに移し替えるのが早いと思います。変異はどこにあるのですか？ 変異は上記しましたように、エクソン25とエクソン26の間のイントロンです。このイントロン内のスプライスアクセプターサイトが変異をしています。 なぜpcDNA3.1+に移し替えるといいのでしょうか...ますます混乱してきてしまいました。このExontrap Cloning Vector pET01はミニジーンを利用したスプライシングアッセイに広く使われているようです。私はこの企業の回し者でもその共同研究者の絶対的な味方というわけではありませんが、今現時点での私の理解では、このベクターを使うことこそがクエッションへの答えを出してくれるのではと考えています... 言葉を紡ぐのが上手ではないので、大変失礼な物言いに聞こえてしまったら本意ではありません。 大変お忙しいなか誠に恐縮ですが、今一度ご意見を聞かせていただけますと幸いです。本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7073-19 - 2018/07/23 (月) 11:58:07 - おお >Exon２５の３’スプライシングサイトが弱いと Exon２５の5’側スプライシングサイトが弱いと

(無題) 削除/引用 No.7073-18 - 2018/07/23 (月) 11:56:50 - おお >なので解決策は150bp程度のイントロンをエクソン25前とエクソン27の後ろに持たせないといけないですよね？ 実際はそれよりもベクターにあるスプライシングサイトが邪魔していると言えるでしょう。Exon２５の３’スプライシングサイトが弱いと上流のIntron部位を加えても同じようなことが起こる可能性があります。真ん中のExon26の挙動を調べたければ、 Kpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1 で十分です。また Kpn1- exon25-intron-exon26-Kpn1 でも結論が出る場合もあります（何が起こっているか、期待しているかによるかもしれませんけど）。 なのでKpn1- exon25-intron-exon26-intron-exon27-Kpn1をpCDNA３．１などの発現ベクターに移し替えるのが早いと思います。変異はどこにあるのですか？

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